Вы находитесь на странице: 1из 75

ОБЩАЯ

ВИРУСОЛОГИЯ

LIVING OR DEAD?
Лектор – к.мед.н.,
доцент Колычева
Наталия
Леонидовна
Вирусология – наука о вирусах
 12 февраля 1892 Д. И. Ивановский открыл
вирус табачной мозаики (ВТМ)
История открытия первых вирусов
1. вирус табачной
мозаики
Ивановский – 12
февраля 1892 г.
2. вирус ящура
Леффлер и Фрош –
1898 г. Установил, что возбудитель мозаичной болезни
3. вирус жёлтой табака, в отличие от бактерий, невидим в
лихорадки микроскоп при самом сильном увеличении,
Рид – 1901 г. проходит через фарфоровые фильтры и не
4. вирус саркомы кур растет на обычных питательных средах.
Раус – 1911 г. Обнаружил в клетках больных растений
5. бактериофаг кристаллические включения («кристаллы
д’Эррель – 1917 г. Ивановского»), открыв, таким образом, особый
мир возбудителей заболеваний
небактериальной и непротозойной природы,
названных впоследствии вирусами. Ивановский
рассматривал их как мельчайшие живые
организмы.
Роль вирусов в истории
человечества

"Virus" is from the Greek meaning for "poison" and was initially described by Edward Jenner in 1798.

• 95% населения Северной и Южной Америк погибло от


“европейских” вирусов – кори, натуральной оспы
• ХХ-ХХI век – грипп, ВИЧ, HBV, HCV
Термин “вирус” означает “яд”.

Вирусы - это неклеточные системы живых


существ, которые отличаются своими малыми
размерами, отсутствием в вирионе
белоксинтезирующих и энергогенерирующих
систем, а также облигатным внутриклеточным
паразитизмом.

Целая вирусная частица называется


вирионом
Основные отличия вирусов от
других форм жизни

1. один тип нуклеиновой


кислоты
2. отсутствие клеточного
строения
-собственного метаболизма
-белоксинтезирующих систем
-энергозапасающих систем
3. возможность интеграции в
клеточный геном и
синхронной с ним
репликации
ВИРУСЫ СУЩЕСТВУЮТ на
4. разобщённый границе между миром
(дисъюнктивный) способ живым и неживым
размножения (репликации)
Sizes of selected virions

Copyright © 2011 Pearson Education Inc. Figure 13.4


Нет
пептидогликана
Экстремально
галофильные
(12-32% NaCl)
Термоацидофи
льные-растут
при 75-90С и
низком рН

Патогенных для
человека видов
нет
Формы вируса
Вирион Вирус
Внеклеточная форма Внутриклеточная форма

• Мелкие (17-25 нм)


• Полиомиелит
• Средние (80-120 нм)
• Грипп
• Крупные (300-400 нм)
• Оспа
Формы существования вирусов

внеклеточная внутриклеточная
(вирион) (вирус)
НК только НК
капсид
[суперкапсид]
Близкие к вирусам инфекционные агенты
если НК + белок = вирус, то:
1. только НК = вироид,
2. только белок = прион.
Viroids
Small, circular
RNA molecules
without a protein
coat
Infect
plants

11
Прионы и медленные инфекции
prion = proteinaceous infectious (particle)
прион = белковая инфекционная (частица)
Формы существования прионового белка
PrPSc (Prion Protein
PrPC (Prion Protein of Cell)- of screpi)-
нормальная форма PrPC PrPSc патологическая
форма
(PrPC) (PrPSc)
Prions

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.


1. Необычно продолжительный (годы)
инкубационный период
2. Медленно прогрессирующий характер течения
3. Необычность поражения органов и тканей
4. Необратимые поражения ЦНС
5. Неизбежность смертельного исхода
6. Практически полное отсутствие значимых
иммунных реакций
7. Формирование в ткани мозга амилоидных
скоплений
8. Генерализованная гипертрофия астроцитов
9. Выраженная губчатая дегенерация
Принцип строения вирусов

простой (<60 субъединиц белка) сложный (>60)

НК + капсид (по 2, 3 или 5 полипептидов =


ПРОСТОЙ капсомер)
спиральная
СЛОЖНЫЙ тип симметрии
ВИРУС

+ суперкапсид кубическая
Вирусы

Простые Сложные
 Содержат
 Нуклеиновую Содержат
• кислоту.
 Белок.
• Нуклеиновую
кислоту.
• Белок.
• Углеводы.
• Липиды.
• Компоненты клетки
хозяина
(суперкапсид).
Virions, complete virus particles

Copyright © 2011 Pearson Education Inc. Figure 13.1


Enveloped viruses

Copyright © 2011 Pearson Education Inc. Figure 13.7


СПИРАЛЬНЫЙ ТИП СИММЕТРИИ

 Вирусы с этим типом симметрии имеют нуклео-


капсид трубчатой формы и состоят из НК,
окруженной тесно прилегающими капсомерами.
*Вирусы с кубическим
типом симметрии
имеют капсид в виде
икосаэдра
(двадцатигранника), в
средине которого
содержится НК или
нуклеопротеид.
Helical
ICOSAHEDRAL
symmetry
SYMMETRY

22
Icosahedral Helical

Naked capsid-
безоболочечные,
голые вирусы

Lipid
Enveloped –
Matrix оболочечные,
Glycoprotein сложные вирусы
Icosahedral naked capsid viruses

Adenovirus Foot and mouth disease virus


Electron micrograph Crystallographic model
Helical naked capsid viruses
RNA Protein

Tobacco mosaic virus Tobacco mosaic virus


Electron micrograph Model
Комбинированный тип
симетрии
• Вирусы с
комбинированным типом
симметрии имеют
нуклеокапсид,
характеризующийся
кубической симметрией, а
расположенный внутри
нуклеопротеид уложен
спирально
ФОРМА ВИРУСОВ
• шаровидная (грипп), палочковидная (бешенство),
нитевидная (филовирусы), кубическая (оспа) и
сперматозоидная (бактериофаг).
Принцип строения суперкапсида

гликопротеины
(шипы, ворсинки)

матричный белок

билипидный
слой

Matrix

Lipid
Glycoprotein
Структура суперкапсида вируса гриппа
суперкапсид
– М-белок
– билипидный слой
– шипы
(гликопротеины –
gp)
• гемагглютинин (НА)
– адсорбция к
эпителию-связь с
сиаловой к-той,
индукция
вируснейтрализиру
ющих Ig
• нейраминидаза HANA
(NА) – отрыв при
отпочковывании Вход Выход
16 подтипов 9 подтипов
КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ
•Сначала ее пытались построить на основе симптомов
заболеваний (пример-гепатиты)
•Потом на основе сходства в нахождении в организме
(миксовирусы)
•Наконец – на основе строения вириона
•И все неудачно!
Основные признаки, используемые для
современной классификации вирусов
1. тип нуклеиновой кислоты
2. структура генома – количество нитей (цепочек)
3. целостность или фрагментированность генома
4. наличие суперкапсида
5. наличие обратной транскриптазы (для отнесения
к семейству ретровирусов)
Baltimore classification
I: dsDNA viruses (e.g. Adenoviruses,
Herpesviruses, Poxviruses)
II: ssDNA viruses (+)sense DNA (Parvoviruses)
Parvoviruses
III: dsRNA viruses (e.g. Reoviruses)
Reoviruses
IV: (+)ssRNA viruses (+)sense RNA (e.g.
Picornaviruses, Togaviruses)
Togaviruses
V: (−)ssRNA viruses (−)sense RNA (e.g.
Orthomyxoviruses, Rhabdoviruses)
Rhabdoviruses
VI: ssRNA-RT viruses (+)sense RNA with DNA
intermediate in life-cycle (Retroviruses)
Retroviruses
VII: dsDNA-RT viruses (e.g. Hepadnaviruses)
Hepadnaviruses
Иерархическая система таксонов,
применяемых в вирусологии
1. Царство
Vira
2. Подцарство
– ДНК-геномные вирусы
– РНК-геномные вирусы
3. Семейство
Название таксона заканчивается на –viridae
4. Подсемейство
Название таксона заканчивается на –virinae (существует у
некоторых семейств)
5. Род
Название таксона заканчивается на –virus. Основной таксон в
классификации вирусов
6. Вирус
7. Серовары
По антигенной структуре
virus classification: DNA Viruses
Family Pox Herpes Adeno Papova Parvo Hepadna

Genome <---------------------------------------ds DNA--------------------------------------> ssDNA Partial dsDNA

Capsid Complex <---------------------------------------------Icosahedral-------------------------------------------------->


symmetry
Envelope <-----------------Yes------------------> <-----------------------------No------------------------------> Yes

Herpes simplex Human Papilloma Adeno- Hepatitis B


e.g. Vaccinia virus
virus 2 adenovirus Associated

Molluscum
Contagiosum
Plus Sense RNA Viruses
Minus Sense RNA Viruses
Размеры вирионов
15-18 нм – 300-400
нм
1. мелкие: <40 нм
– ДНК
• Parvo-
– РНК
• Picorna-
• Calici-
2. средние: 40 –
130 нм
3. крупные: >130
нм
– ДНК
• Pox-
• Herpes-
– РНК
• Paramyxo-
• Rhabdo-
• Arena-
Общая характеристика
РНК вирусов
*форма:
*линейная • форма:
*кольцевая – линейная
*на концах – – кольцевая
идентичные
повторы: • структура:
*маркеры вирусной – цельная
(не клеточной) – фрагментированная
ДНК
• информационная функция:
*способны
замыкать ДНК в +нить (позитивный геном) =
кольцо иРНК сразу может
* репликация транслироваться без
* транскрипция транскрипции
* устойчивость к
клеточным -нить (негативный геном) ≠
эндонуклеазам
* интеграция в иРНК сначала
клеточный геном транскрипция, потом
трансляция
1. Структурные
* капсидные
* «внутренние», гистоноподобные (НК 
рибо/дезоксирибонуклеопротеин)
2. Функциональные (ферменты)
* вирионные
* вирусиндуцированные
* вирус может модифицировать клеточные ферменты
Строгий цитотропизм вирусов
Способность вирусов к репликации только в строго
определённых клетках и органах
• поражаемая клетка должна иметь соответствующие
данному вирусу:
– рецепторы для адсорбции
– ферменты депротеинизации
*Репродукция вирусов
1. Адсорбция вируса на поверхности клетки

2. Проникновение внутрь

3. «Раздевание» вирионов

4. Синтез компонентов вириона

5. Сборка вириона

6. Выход вириона из клетки


Способы проникновения вирусов в клетки
1. Виропексис (рецепторный эндоцитоз)
2. Слияние мембран
3. Прямая пенетрация
Виропексис (на примере вируса
гриппа)
НА-сиаловая к-та
Слияние мембран (на примере
ВИЧ)
gp120-CD4
Освобождение нуклеиновой кислоты
путём сброса вирусом белковой (-ых)
оболочки (-чек)
1. При виропексисе – в эндоцитозном
пузырьке (у сложных – может
завершаться при проникновении в
ядро клетки)
2. При слиянии мембран –
одновременно с проникновением
Центральная догма молекулярной биологии — обобщающее наблюдаемое в
природе правило реализации генетической информации: информация
передаётся от нуклеиновых кислот к белку, но не в обратном направлении.

3 класса способов передачи информации, описываемые догмой


Специальные Неизвестные и
Общие
(у вирусов) малоизученные
ДНК → ДНК
РНК → ДНК белок → ДНК
(репликация)
ДНК → РНК
РНК → РНК белок → РНК
(транскрипция)
РНК → белок белок → белок
ДНК → белок
(трансляция) (прионы)
РНК-вирусы
ДНК-
вирусы -нить +нить Retro-

ДНК РНК РНК РНК


   
мРНК мРНК белок ДНК
  
белок белок РНК

белок
Синтез ранних и поздних белков
ранние > репликация НК > поздние
РАЗНООБРАЗИЕ РАЗМЕРОВ ГЕНОМОВ.

Arabidopsis thaliana 21000 генов.


ДНК-ВИРУСЫ.
(двунитевые ДНК)
Mimivirus (mimicring microbes).
Ø 400 nm+80nm; >1000 генов; 500 млн.Da, 1182 kbp .
Вирус оспы 150- 300 генов; 160млн.Da, 150-300 kbp.
Бактериофагаг Т4 300 генов; 120 млн. Da, 169 kbp.
Вирус герпеса - 70 генов; 100млн.Da, 120 kbp.
Аденовирус 40 генов; 25 млн. Da, 26-46 kbp.
Папиллома - 8 генов; 3.2 млн. Da, 7.0-8.4 kbp.
Однонитевые ДНК:
Бактериофаг М13 -10 генов; 8 kb.
Парвовирус – 6 генов; 1.5 млн. Da; 5 kb.
РАЗНООБРАЗИЕ РАЗМЕРОВ ГЕНОМОВ
(РНК-вирусы)
• Коронавирус 7 генов;>30 млн.Da, 30 kb.
• ВТМ- 3-4 гена;2 млн. Da, 6.4 kb.
• РНК-фаг - 4 гена; 1.5 млн.Da, 3.4-4.2 kb.
• Астровирусы - 2 гена; 1 млн. Da, 6-7 kb.
• Нарнавирусы – кодируют 1 белок; геном-
20S РНК, 2.3-3.0 kb.
НК вируса в клетке

интеграция в продуктивная
плазмида
геном инфекция

латен- латен- выде-


опу- тная опу- тная ление
лизис
холь инфек- холь инфек- без
ция ция лизиса
ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИКИ
ВИРУСОВ
1. Генетическая обмен
рекомбинация генетическим
материалом
2. Генетическая
реактивация
3. Комплементация нет обмена
генетическим
4. Фенотипическое материалом
смешивание
Генетическая реактивация
вирус 1 + вирус 2  в одной клетке

вирус 1 вирус 2
(инакт. гены 1, 2, 3) (инакт. гены 4, 5, 6)

вирус
(все гены 1 – 6 активированы)
Наблюдается между геномами родственных вирусов, имеющих
мутации в разных генах. В результате перераспределения генетического
материала формируется полноценный дочерний геном
Комплементация
вирус 1 + вирус 2  в одной клетке

вирус 1

белок

репродукция вируса 2
Один из вирусов (2) синтезирует нефункциональный
белок в рез-те мутации. Немутантный вирус (1), синтезируя
полноценный белок, восполняет его отсутствие у мутантного
вируса
Фенотипическое смешивание
вирус 1 + вирус 2  в одной клетке

вирус 1 вирус 2

НК 1

капсид 2

При смешанном заражении клетки двумя вирусами часть потомства


приобретает фенотипические признаки, присущие двум вирусам, при сохранении
неизменности генотипа
1. возможность интегративной
инфекции (вирогении)
2. стадия вирусемии (кроме вирусов,
распространяющихся нейрогенным
путём)
3. поражение иммунокомпетентых
клеток  иммунопатологические
состояния
4. м.б. пожизненная персистенция
На клетки: На организм:
*цитопатическое *иммунотропное действие –
действие – повреждение поражение ИКК
клеток вплоть до их *толерогенное действие –
гибели индуцирование
*иммуноопосредованное иммунологической
поражение – толерантности
аутоиммунная реакция *онкогенное действие –
индуцирование опухолевого
перерождения
*тератогенное действие –
поражение плода
Действие факторов
противовирусного иммунитета
вирион

проникновение
в клетку
Ig NK
инфицированная ЦТЛ (Tk)
Действуют
только вне клетка
клетки
ИФН
проникновение в
соседние клетки
1.Цитологический
2.Вирусологический
3.Серологический
4.Молекулярно-
генетический
Культивирование вирусов

Куриные эмбрионы 6-
12 дневного
возраста.
Способы заражения -
открытый, закрытый
Inoculation sites for the culture of viruses in eggs

Copyright © 2011 Pearson Education Inc. Figure 13.18


Культивирование вирусов
Культуры клеток: - первично-трипсинизированные
культуры эмбрионов человека, почек мартышек,
фибробластов эмбриона курицы и тому подобное;
способные расти на протяжении нескольких пасса-
жей как вторичные культуры; перевиваемые
клетки; они представляют собой культуры клеток,
которые приобрели способность к неограниченному
росту и размножению; Их получают из опухолей или
из нормальных человеческих или животных тканей,
которые имеют измененный кариотип. HeLa
(карцинома шейки матки) Hep-2 (карцинома
гортани человека), КВ (карцинома ротовой полости
человека), RD (рабдомиосаркома человека), RH
(почка эмбриона человека), Vero (почка зеленой
мартышки), СПЭВ (почка эмбриона свиньи), ВНК-
32 (почка сирийского хомяка)
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.
Культуры клеток
диплоидные клетки; они представляют собой
культуры клетки одного типа, имеют диплоид-
ный набор хромосом и способные выдерживать
при этом до 100 пересеваний в условиях лабора-
тории. Они являются удобной моделью для
получения вакцинных препаратов вирусов, так
как свободные от контаминации инородными
вирусами, хранят исходный кариотип во время
пассажей, не имеют онкогенной активности.
Чаще всего пользуются линиями культур,
которые получены с фибробластов эмбриона
человека (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), коров,
свиней, овец и тому подобное. Культуры клеток
хранят в замороженном состоянии.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.
Питательные среды, которые используются для
поддержки культур клеток или их роста бывают
естественными или синтетическими
(искусственными).
Естественные среды - сыворотка крови крупного
рогатого скота, жидкости из серозных полостей,
продукты гидролиза молока, многообразные
гидролизаты (5 % гемогидролизат, 0,5 %
гидролизат лактоальбумина) или экстракты тканей.
Их химический состав помогает создать условия,
какие подобные к тем, что существуют в организме
человека. Существенным недостатком таких сред
считается их нестандартность, ведь качественный и
количественный состав компонентов, которые входят
к их составу, может изменяться.

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.


Синтетические питательные среды не имеют этого
недостатка, ведь их химический состав стандартен,
потому что их получают комбинируя многообразные
солевые растворы (витамины, аминокислоты) в
искусственных условиях. К таким наиболее
употребимым растворам принадлежат среда 199
(культивирование первинно-трипсинизированных и
перевиваемых культур клеток), среда Игла (содержит
минимальный набор аминокислот и витаминов и
используется для культивирования диплоидных
линий клеток и перевиваемых), среда Игла МЕМ
(культивирование особенно требовательных линий
клеток), раствор Хенкса, что используется для
изготовления питательных сред, отмывания клеток и
тому подобное.

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.


Культивирование вирусов

Виды культур клеток


• Неперевиваемые клетки (in vitro не
размножаются).
• Полуперевиваемые клетки (50 генераций).
• Перевиваемые (раковые клетки или
нормальные клетки зародыша).
Критерии:
• Цитопатическое действие (ЦПД)
• Включения
• Образование бляшек
• Гемадсорбция
• “Цветная” проба.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.
Цитопатическое действие

1. Полная дегенерация клеточного монослоя.Отдельные клетки,


которые остаются живыми, изменяют свою морфологию, у них
заметный пикноз ядра и цитоплазмы (пикорнавирусы -вирусы
полиомиелита Коксаки, ЕСНО).
2. Симпластообразующий тип ЦПД (возбудители кори,
эпидемического паротита, парагриппа, респираторно-
синцитиальных вирусов). Возникают многоядерные гигантские
клетки (симпласты или синцитии).
3. Круглоклеточная дегенерация (аденовирусы).
При репродукции риновирусов образуются округлые клетки,
которые имеют отростки, а при размножении герпесвирусов
наблюдается формирование подобных клеток одинакового
размера, которые разбросаны по всему монослою.
4. Пролиферативный тип изменений (онкогенные вирусы) -
формирование нескольких слоев клеток.

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.


Заражение лабораторных животных.
Многочисленные лабораторные животные широко
используются в вирусологии для выделения и
идентификации вирусов, получения специфических
противовирусных сывороток, изучения
многообразных аспектов патогенеза вирусных
заболеваний, разработки способов борьбы с
заболеваниями и их профилактики. Чаще всего
используют белых мышей разного возраста
(двухдневного возраста), белых крыс, гвинейских
свинок, кролей, сусликов, хлопчатниковых крыс,
мартышек и других.

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.


Существуют многообразные способы заражения
животных в зависимости от тропизма вирусов,
клинической картины заболевания и тому подобное.
Исследуемый материал можно вводить:
- через рот
- в дыхательные пути (ингаляторно, через нос)
- накожный
- внутрикожно
- подкожно, внутримышечный
- внутривенно
- внутрибрюшинно
- внутрисердечно
- на скарифицированную роговицу
- в переднюю камеру глаза
- в мозг.

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.


Для выделения вирусов простого герпеса,
натуральной оспы используют заражение
лабораторных животных (кроликов) на
скарифицированную роговицу глаза.
При исследовании вирусов гепатита А вводят
исследуемый материал через рот.
При выделении вирусов с нейротропными
свойствами, таких как арбовирусы, вирусы
бешенства, полиомиелита, Коксаки целесообразно
заражать белых мышей (1-2-дневных сосунков) в
мозг.

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.


PLAQUE ASSAY

69
PLAQUE ASSAY

70
PLAQUE ASSAY

71
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Цели
• обнаружение в патологическом
материале конкретного вида
микроорганизма без выделения
чистой культуры
• идентификация микроорганизмов
• генотипирование микроорганизмов
Праймеры для ПЦР
Праймер (англ. primer) — это короткий фрагмент НК, который
служит стартовой точкой при репликации ДНК. Праймеры
необходимы ДНК-полимеразам, так как ДНК-полимеразы могут
только наращивать существующую цепь.
• Создание своих праймеров
• Программы: PrimerSelect (DNASTAR), Oligo
• Необходимо знать последовательность (генбанк)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Принцип осуществления
патологический материал или штамм микроорганизма

выделение ДНК

нагрев

расплетение ДНК на две нити

добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3’-
концам искомого гена)

охлаждение

связывание праймеров с комплементарными участками искомого
гена

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Принцип осуществления

добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов

нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров

повторение циклов (30-80) – накопление (амплификация)
искомого гена

резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества
искомого гена

определение количества ДНК с помощью электрофореза
+ количество ДНК увеличивается
– количество ДНК не увеличивается
• Выделенная ДНК
• Буфер
• Mg
• dNTPs (dA, dC, dT, dG)
• Термостойкая ДНК-
полимераза –
-Taq-полимераза -
Thermus aquaticus
-Pfu-полимераза -
Pyrococcus furiosus
-Pwo-полимераза-
Pyrococcus woesei
• Праймеры («туда и
обратно») –
cпецифичность
реакции
• Амплификатор