Методы молекулярной биологии

ПЦР – метод амплификации

нуклеиновых кислот
полимеразной цепной реакцией
 Watson & Crick
J. D. WATSON and F. H. C. CRICK
A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid
Nature, 2 April 1953, VOL 171,737 1953

The work which began

with Avery's identification
of DNA as the
"transforming principle"
thus led to research that This is a picture of
overturned the old part of the original
conception of DNA as a model built by
repetitive and simple Watson and Crick
molecule, confirmed DNA's at Cambridge in
role in genetic 1953.
transmission, and, with
James Watson and Francis
Crick's 1953 paper,
elucidated its structure.
 Принцип комплементарности и
антипараллельности цепей ДНК
История открытия ПЦР

Лауреат Нобелевской
премии по химии 1993 года
Кари Маллис (Kary Mullis)
 Принцип метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод

амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в
течение нескольких часов можно выделить и
размножить определённую последовательность ДНК
в миллиарды раз. Возможность получения огромного
количества копий одного строго определённого
участка генома значительно упрощает исследование
имеющегося образца ДНК.

В основе метода ПЦР лежит уникальное свойство НК (как

ДНК, так и РНК) - способность к саморепродукции, которая
воспроизводится искусственно in vitro. При этом
синтезируются только строго специфические фрагменты
НК.
Компоненты реакционной смеси для ПЦР

1. Анализируемый образец – подготовленный к внесению в

реакционную смесь препарат, который может содержать искомую
ДНК, служащую мишенью для последующего многократного
копирования (например, ДНК микроорганизмов). При отсутствии
ДНК-мишени специфический продукт амплификации не
образуется
2. Праймеры – пара искусственно синтезированных
олигонуклеотидов, имеющих, как правило, размер от 15 до 30
п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они
играют ключевую роль в образовании продуктов реакции
амплификации. Правильно подобранные праймеры
обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.
Компоненты реакционной смеси для ПЦР

3. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) –

дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат
(дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и
дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) – «строительный материал»,
используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК
4. Taq-полимераза – термостабильный фермент, обеспечивающий
достраивание 3’-конца второй цепи ДНК согласно принципу
комплементарности (энзим термофильных бактерий Termus
aquaticus).
Вышеуказанную реакционную смесь подвергают
повторным циклам нагревания/охлаждения для
денатурации (при нагревании) НК и
гибридизации или отжиге (при охлаждении)
праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-
полимеразы) новых НК.
При нагревании две комплементарные
нити ДНК расходятся – она плавится
• PCR Biotechnique
ПЦР: Полимеразная Цепная
Реакция
(Andy Vierstraete, 2001)

Полимеразная реакция
проходит автоматически в
программируемом
термостате –
термоциклере
(амплификаторе),
который может нагревать
и охлаждать пробирки с
реакционной смесью в
очень короткое время.
Трехступенчатый цикл, в
результате которого
получаются точные копии
идентифицируемого
участка матричной НК,
повторяется 30-50 раз в
соответствии с заданной
программой термоциклера
 Экспоненциальная амплификация ДНК
в ПЦР
(Andy Vierstraete, 2001)

Один цикл продолжается примерно 3 минуты, и через 2 часа можно получить около миллиарда копий
определяемой последовательности НК. Если в растворе не окажется ни одной молекулы НК с участком,
комплементарным внесенным праймерам, даже, несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других
молекул НК, реакция ПЦР не пройдет. После 25-30 циклов экспоненциального нарастания продуктов реакции
происходит выход на плато из-за истощения трифосфатов, праймеров и повреждений полимеразы. Поскольку
праймеры физически включаются в концы ампликонов, этим самым детерминируется продукт ПЦР – фрагмент
НК. Кроме того, ДНК-полимераза обладает способностью выбраковывать (редактировать) ошибочные
некомплементарные нуклеотиды. Этим достигается высокая специфичность результатов исследования.
Продукты ПЦР, или ампликоны, представляющие собой участок синтетической НК, ограниченный праймерами,
на конечной стадии ПЦР идентифицируют методом элетрофореза в геле
Три цикла реакции ПЦР-амплификации
ДНК
Результатом циклического синтеза является
экспоненциальное увеличение количества
специфического фрагмента ДНК

А = М* (1+Е)n, 

где А - количество специфических (ограниченных

праймерами) продуктов реакции амплификации;
М – начальное количество ДНК-мишеней;
n - число циклов амплификации
Е – значение эффективности реакции

Фактически значение эффективности отдельных циклов

амплификации составляет, по некоторым данным, 78-97%.
В случае присутствия в пробе ингибиторов реакции это значение
может быть намного меньше
Специфичность ПЦР
Оценка результатов реакции

• Метод горизонтального электрофореза

• Метод вертикального электрофореза
• Метод гибридизационных зондов
 Организация технологического
процесса постановки ПЦР
ПЦР-лаборатория должна быть разделена на три зоны
– по числу технологических операций:

Все три зоны должны быть изолированными комнатами,

снабженными предбоксниками. Полезно иметь
устройство фильтрации воздуха
Амплификатор для проведения ПЦР
Применение метода ПЦР в клинической
диагностике
• Ранняя диагностики инфекционных заболеваний у серонегативных
пациентов, когда лечение наиболее эффективно;
• выявление персистирующих, латентных и рецидивирующих форм
инфекций;
• контроль эффективности лечения;
• диагностика оппортунистических инфекций, часто протекающих на
фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза
только по результатам серологических исследований затруднена
из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного
ответа и протекания заболевания;
• разрешение сомнительных результатов серологических
исследований;
• эпидемиологические исследования;
• выявление наиболее патогенных штаммов инфекционных агентов;
• исследование инфекционности пулированных образцов крови и ее
продуктов, применяемых в терапии
Области применения ДНК-диагностики
• акушерско-гинекологическая практика,
• неонатология,
• педиатрия,
• урология,
• венерология,
• нефрология,
• гепатология,
• пульмонология,
• офтальмология,
• неврология,
• фтизиатрия
• пренатальная диагностика наследственных заболеваний
(муковисцидоз, фенилкетонурия, гемофилия и пр.),
• установление отцовства
 Система полуколичественной оценки
результатов анализа:

+ - 50-500 копий геномов на пробу;

++ - 500-5000 копий геномов на пробу;
+++ - 5000-50000 копий геномов на пробу;
++++ - более 50000 копий геномов на пробу;
Инфекционные агенты, выявляемые с
помощью ПЦР-анализа
Инфекционный агент НК Исследуемый материал
сыворотка и клетки крови, моча,
ЦМВ ДНК
слюна, ликвор, соскоб эпителия
ВПГ ДНК -//-
Герпес-вирус типа 6 (HHV-6) ДНК -//-
Хламидии (trachomat is) ДНК соскоб эпителия, моча, мокрота
Уреаплазмы (urea lit icu m) ДНК -//-
Микоплазмы (ho minis) ДНК -//-
Трихомонады (vaginalis) ДНК -//-
Гонококки (gonorrhoeae neisseria) ДНК -//-
Гарднерелла (vaginalis) ДНК -//-
Листерии (monocytogenes) ДНК -//-
Микобактерии
ДНК Мокрота, моча, сыворотка крови
(tuberculosis)
ВИЧ кДНК, РНК сыворотка и клетки крови
 ДНК-идентификация

Система CODIS.

Желтым цветом обозначено положение

локусов STR на хромосомах.
Установление отцовства

Результаты электрофореза
ДНК-фрагментов,
амплифицированных с помощью
ПЦР.

(1)Отец. (2) Ребенок. (3) Мать.

(2) Ребенок унаследовал
некоторые особенности
генетического отпечатка обоих
родителей, что дало новый,
уникальный отпечаток
 Отец ли он?

Аллели генотипа по локусам

Локусы
Мать Ребенок Отец

D7S820 10-10 10-10 10-10

THO 1 07-07 03-06 03-07