сайты связывания

транскрипционных TATA
факторов (не всегда)

UAS core promoter inr ген

Upstream Activating Sequences участок начала
транскрипции
YYANt/aYY
пиримидиновый бокс
для инициации транскрипции РНК полимеразой II необходимы шесть так
называемых «общих» (general) факторов транскрипции

сайты связывания
транскрипционных TATA
факторов (не всегда)

UAS core promoter inr ген

Upstream Activating Sequences участок начала
транскрипции
YYANt/aYY
пиримидиновый бокс
TAFs (TBP-associated factors)
обеспечивают связывание
с промоторами, не содержащими
ТАТА бокса

содержат участки взаимодействия с TFIID

тканеспецифичными транскрипционными
факторами TAFs
TBP
TAF(II)250 имеет активность ацетилтрансферазы
TAF(II)55 ингибирует эту активность

сайты связывания
транскрипционных TATA
факторов (не всегда)

UAS core promoter inr ген

Upstream Activating Sequences участок начала
транскрипции
YYANt/aYY
пиримидиновый бокс
 При наличии сильного промотора с ТАТА
боксом один TBP может заменить TFIID и
обеспечить инициацию транскрипции по
крайней мере in vitro

TBP

сайты связывания
транскрипционных TATA
факторов (не всегда)

UAS core promoter inr ген

Upstream Activating Sequences участок начала
транскрипции
YYANt/aYY
пиримидиновый бокс
различные транскрипционные факторы

TAFs TFIID

TBP
UAS
TATA inr ген
core promoter участок начала
транскрипции
YYANt/aYY
пиримидиновый бокс
 TAFs TFIID

TBP
UAS
inr ген
TFIIA TFIIB

TFIIA и TFIIB стабилизируют взаимодействие

TBP с ДНК, контактируя одновременно с ДНК и TBP
 TAFs TFIID Pol II
TFIIF
TBP
UAS
inr ген
TFIIA TFIIB

TFIIF обеспечивает посадку РНК полимеразы II

на формирующийся коплекс
 TAFs TFIID Pol II
TFIIF
TBP
UAS
TFIIH ген
TFIIA TFIIB
TFIIE

Последними к комплексу присоединяются TFIIE и TFIIH. TFIIH

представляет собой АТФ-зависимую ДНК-хеликазу, которая
обеспечивает локальное плавление ДНК в точке начала транскрипции
Промотор узнает не РНК полимераза II, а входящий в состав TFIID фактор TBP

Даже в том случае, когда промотр не имеет выраженного ТАТА бокса, ключевую роль
в узнавании промотора играет фактор TFIID, который взаимодействует с
транскрипционными факторами, связанными с UAS. Функцию посредников при этом
выполняют TAFs.

Остальные “общие” транскипционные факторы стабилизируют комплекс РНК

Полимеразы II с промотором и обеспечивают локальное плавление ДНК
Перед началом элонгации выделяют особую стадию «освобождения промотора» При этом часть
общих транскрипционных факторов остается на промоторе, тогда как другие (TFIIF)
перемещаются вместе с элонгирующим полимеразным комплексом.
В момент освобождения промотора элонгирующий комплекс остается крайне нестабильным
и может легко «соскачить с ДНК». Комплекс заметно стабилизируется после включения
8-9 нуклеотидных остатков (именно такова длина ДНК-РНК гибрида в составе транскрипционного
комплекса)

Важную роль в переходе от «инициаторного» к элонгирующему комплексу играет

фософорилирование сериновых остатков 2 и 5 в повторяющихся много раз гегтапептидах
YSPTSPS С’-концевого домена каталитической субъединицы РНК-полимеразы II.

Первичное фосфорилирование серинов 5 осуществляет киназная субъединица (Kin28)

транскрипционного фактора TFIIH
Для РНК полимеразы II и ее аналогов у других организмов характерна тенденция к
временной (пауза) или бессрочной (арест) остановке элонгации. Для обеспечения
эффективной элонгации необходим целый ряд вспомогательных факторов, один из
которых (TFIIF) является общим фактором транскрипции.

Существует и негативный фактор

элонгации NELF, который стимулирует
остановку PolII.
NELF связывается с комплексом
PolII-DSIF

стимулирует РНказную активность

полимеразы II
 Энхансеры и сайленсеры модулируют «скорость» транскрипции

1
минимальный ген-репортер (САТ)
промотор
2 энхансер
минимальный ген-репортер (САТ)
промотор

3 энхансер
минимальный ген-репортер (САТ)
промотор

количество
продукта
или
мРНК

1 2 3
номер конструкта
 Энхансеры могут располагаться где угодно

перед промотором
иногда непосредственно и тогда они фактически выполняют роль UAS
иногда на большом расстоянии (более 100 Kb)

р
ген

р
ген

внутри гена

р
ген

после гена

р
ген
Не вполне ясно, что именно регулируют энхансеры

А. Скорость работы промотора (число инициаций в единицу времени) ?

Б. Статус промотора (активный / неактивный) ?

Механизм работы энхансеров также остается неясным

Все известные в настоящее время энхансеры представляют собой площадки
для связывания транскрипционных факторов.

Транскрипционные факторы могут быть универсальными и тканеспецифичными

Соответсвенно, и энхансеры могут быть универсальными и тканеспецифичными

Большинстви вирусных энхансеров являются универсальными

Энхансеры вирусов SV-40, Polyoma, CMV

универсальный транскрипционный фактор Sp1

Примером тканеспецифичных энхансеров могут служить энхансеры глобиновых генов

эритроид-специфичный транскрипционный фактор GATA-1

Перед началом активной транскрипции должна быть осуществлена активация хроматина

Ацетилирование гистонов

Ремоделирование нуклеосом (SWI/SNF)

Удаление белков гетерохроматина (HP1)

Замещение стандартных нуклеосмом
нуклеосомами, содержащими вариантные
формы гистонов (Н3.3, Н2A.Z)
 NuRF

UAS core promoter inr ген

 NuRF

UAS core promoter inr ген

 NuRF

UAS core promoter inr ген

 NuRF

TFIID

TBP

UAS core promoter inr ген

 NuRF

DNase I HSS

TFIID
Pol II
TFIIF
TBP
UAS

core promoter TFIIH

inr ген
TFIIA TFIIB
TFIIE
 Расстояние между промотором и активаторным участком часто
бывает достаточно большим. Тогда возникает два HSS - на
промоторе и на активаторном участке

TFIID
Pol II
HSS на
активаторном TFIIF
UAS

участке TBP
core promoter TFIIH
inr ген
TFIIA TFIIB
TFIIE

HSS на
промоторе
Большинство специфических транскрипционных факторов содержат ДНК-связывающий

и активаторный домены. Специфичность взаимодействия определяется ДНК-

связывающим доменом.

Активаторные домены являются достаточно разнообразными

(нет никакого консенсуса, часто просто аминокислотная последовательность с

чередующимися кислыми и гидрофобными аминокислотными остатками).

Активаторные домены большинства транскрипционных факторов (даже из разных

организмов) являются взаимозаменяемыми.

Что именно является мишенью для активаторных доменов остается не ясным.

 ОРГАНИЗАЦИЯ ДОМЕНА β - ГЛОБИНОВЫХ
ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА
-18 -10,9
-21,5 -14,7 -6,1

эмбриональный фетальные взрослые

 ДЕЛЕЦИИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТАЛАССЕМИЯХ

-18 -10,9
-21,5 -14,7 -6,1

-18 -10,9
-21,5 -14,7 -6,1
При Испанской талассемии домен β - глобиновых генов утрачивает
предпочтительную чувствительность к ДНКазе и изменяется время
его репликации (реплицируется в конце S фазы )
 Регуляторные элементы, локализованные в 5’- концевой области домена
β - глобиновых генов кур, обеспечивают высокий и не зависящий от позиции
интеграции уровень экспрессии трансгенов в эритроидных клетках
трансгенных мышей (Grosveld et al. 1987).

-18 -10,9
-21,5 -14,7 -6,1

β - глобинового гена
Уровень экспрессии
β

10 20
Число копий
Идентификация LCR в домене бета-глобиновых генов
базировалась на двух группах экспериментальных
результатов:

1. Анализ последствий делеций в 5’-концевой

области домена

2. Изучение влияния изучаемых регуляторных

элементов на экспрессию трансгенов
HS5 HS4 HS3 HS2 HS1

β
HS5 HS4 HS3 HS2 HS1

HS1

HS2 β
“Транзиент” трансфекция
HS3 β

HS4 β

HS5 β Анализ характера экспрессии в

тканях трансгенных мышей
β
HS1

Не выраженная активность в обоих типах

β экспериментов

HS2 Сильный эритроид-специфичный энхансер

В трансгенных мышах обеспечивается высокий
и не зависящий от позиции интеграции уровень
β экспрессии в эритроиднах клетках

HS3
Эритроид-специфичный энхансер
В трансгенных мышах обеспечивается высокий
β и не зависящий от позиции интеграции уровень
экспрессии в эритроиднах клетках

HS4
Эритроид-специфичный энхансер
В трансгенных мышах обеспечивается высокий
β и не зависящий от позиции интеграции уровень
экспрессии в эритроиднах клетках

HS5
Инсулятор, работающих в разных типах тканей
и в клетках разных организмов
β MAR элемент
 Фрагменты ДНК, взаимодействующие с белками, можно идентифицировать
с использованием метода band-shift. В дальнейшем сайты связывания белков
можно картировать с использованием различных вариантов фут-принтинга

band-shift footprinting
экстракт
специфический
конкурент
 In vivo footprinting

Внесение разрывов или других модификаций в ДНК in vivo

Выделение ДНК

Синтез комплементарных цепей, начиная со специфического

праймера ( )

Лигирование асимметричного фрагмента ДНК ( ),

содержащего второй праймер

“Горячий” PCR
Во фрагментах LCR, проявляющих энхансерную активность,
обнаружены многочисленные участки связывания различных
транскрипционных факторов, в том числе:

GATA-1, NF-E2, AP1, CP2, EKLF

Продемонстрировано, что в эритроидных клетках,

продуцирующих глобины, эти факторы связаны с LCR in vivo
 In vivo footprinting on HS2 and HS3

HS2 HS3
Регуляторные последовательности, расположенные в участках
гиперчувствительности 1 - 4 по6разному влияют на активацию
экспрессии различных глобиновых генов по ходу развития
(Frazer et al., 1993)
Регуляторные последовательности, расположенные в участках
гиперчувствительности 1 - 4 по-разному влияют на активацию
экспрессии различных глобиновых генов по ходу развития
(Frazer et al., 1993)

Ни один из тестированных HS не обеспечивал предпочтительной экспрессии фетальных

генов на соответствующей стадии развития плода. Детектируемый уровень экспрессии этих
генов на правильной стадии обеспечивался только при их интеграции в составе конструкта,
содержащего HS3
Правильная временная активация экспрессии различных
глобиновых генов человека в развивающемся эмбрионе трансгенных
мышей происходит лишь при интеграции в мышиный геном
конструктов, включающих полноразмерный домен β - глобиновых генов
человека с LCR и фланкирующими последовательностями
(инсерции размером 150 Kb [Gaensler et al, 1993], 248 Kb [Peterson et al.,
1993], 160 Kb [Huang et al., 2000].
 Области контроля локуса β - глобиновых генов
различных
млекопитающих организованы сходным образом
 МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ LCR

1. Прямое взаимодействие LCR с промоторами индивидуальных генов,

Конкуренция промоторов за контакт с LCR

2. Распространение некого активирующего сигнала от LCR в сторону

промоторов. Сборка исходного активирующего комплекса на LCR
обеспечивается высокой концентрацией участков связывания
белковых факторов

3. Перемещение домена из неактивного компартмента ядра в активный

Looping model
 Механизм действия LCR
“flip-flop” модель
mouse human

В каждый конкретный момент должен экспрессироваться лишь один из генов домена

Порядок активации экспрессии индивидуальных генов домена по ходу развития

организма должен определяться позицией гена по отношению к LCR
 Ген, расположенный ближе всего к LCR,
предпочтительно экспрессируется в эмбрионах
трансгенных мышей

Yolk-sac Fetal liver Adult

Tanimoto et al., 1999

 Действие LCR
имеет направленный характер

Yolk sac Adult

Распространение активационного сигнала от LCR к промоторам

P1 P2 P3
LCR

P1 P2
 РНК-полимераза может служить
“транспортным средством”, обеспечивающим
распространение активационных сигналов от LCR
к промоторам индивидуальных генов
Travers, 1999
 Деффекты LCR могут быть компенсированы посредством
оверэкспрессии транскрипционного фактора EKLF

Crossing to mice overexpressing EKLF

or defective on EKLF expression
EKLF - erythroid-specific transcription
factor (zinc-finger protein) that interacts
with GT motif in β - globin gene promoter
and in the LCR. This factor is required
for β - globin gene expression in the
definitive stage. It is also known to interact with
SWI/SNF family of proteins.
Дополнительные аргументы в пользу модели, предполагающей,
что оновной чертой LCR является высокая концентрация участков связывания
транскрипционных факторов, взаимодействующих и с другими регуляторными
последовательностями

1. Не обнаружено ни одного белкового фактора, способного связываться

только с регуляторными элементами типа LCR

2. Отдельные HSS из LCR домена β - глобиновых генов человека и других

LCR способны защищать трансген от позиционных эффектов только при
множественной интеграции (Ellis et al., 1993; Sabbatini et al., 1999)
HS2 области контроля локуса β - глобиновых генов
человека обеспечивает перемещение трансгена из
гетерохроматиновой в эухроматиновую область
(Francastel et al., 1999)
HS2

β β

трансген

Центромерный
гетерохроматин

Трансген предпочтительно Трансген относительно

чувствителен к ДНКазе и резистентен к ДНКазе и
активно экспрессируется не экспрессируется
Deletions at the Mouse LCR
5’ HS sites
4.2
–62.5 –60.7 6 5 4 3 2 1
MOR MOR MOR MOR MOR
5’β5 5’β4 5’β3 5’β2 5’β1
ε y gene

∆ 4.2, 5, 6, 5’β1
Open chromatin conformation
Normal or near normal gene expression ∆ 5,6 ∆ 4 ∆ 3 ∆ 2 ∆ 1

∆ 1–6
Open chromatin conformation
Very low level of gene expression
∆ 1–4

Deletions at the Human LCR

5’ HS sites
7 6 5 4 3 2 1
HOR HOR HOR HOR HOR HOR
5’β6 5’β5 5’β4 5’β3 5’β2 5’β1
ε gene

ERV-9

Open chromatin conformation ∆ 2–5

No gene expression

Hispanic deletion (∆ 2–5 + 27 kb)

Closed chromatin conformation
No gene expression
Некоторые делеции в 3’-концевой области домена приводят к талассемиям, связанным с тем,
что в эмбриональных клетках начинают экспрессироваться “взрослые” гены

-18 -10,9
-21,5 -14,7 -6,1

эмбриональный фетальные взрослые

инсулятор энхансер

-18 -10,9
-21,5 -14,7 -6,1

эмбриональный фетальные взрослые

делеция энхансер
 Инсуляторы - функциональные
элементы генома, способные
разделять домены
Инсуляторы предотвращают действие энхансера на промотор,
расположенный за инсулятором, не подавляя активностиэнхансера и не
препятствуя его действию в другом направлении

ген А ген В

энхансер
инсулятор
О наличии в том или ином фрагменте ДНК блокирующей энхансеры
активности можно судить в эксперименте по подавлению уровня

экспрессии гена неомицина

 Раньше считалось, что блокирующую энхансер
активность инсулятора можно наблюдать только
после интеграции конструкта в геном клетки-мишени.

Недавно было показано, что аналогичный эффект

можно наблюдать и на кольцевых плазмидах,
присутствующих в клетке в виде эписом.

P
P CAT gene P
CAT gene CAT gene
INS INS
β/ε enhancer β/ε enhancer
β/ε enhancer
INS

Относительная активность CAT

CAT-β/ε enhancer
CAT-INS-β/ε enhancer
CAT-INS-β/ε enhancer-INS

50% 100%
 Инсуляторы - функциональные
элементы генома, способные
разделять домены
Инсуляторы ограничивают распространение на окруженный инсуляторами
трансген негативных сигналов из хроматина хозяйской клетки

трансген
Гетерохроматин Гетерохроматин
хозяйской клетки хозяйской клетки
инсулятор
Не все инсуляторы обладают одновременно способностью
направленно подавлять действие энхансера
(“enhancer-blocking”) и подавлять распространение негативных
хроматиновых сигналов в участке интеграции (“domain boundary”).

В инсуляторах, проявляющих обе активности, разные

функциональные домены ответственны “enhancer-blocking”
и domain boundary. Можно, получить делеционные мутанты,
утратившие лишь одну из этих активностей.
 Один из наиболее хорошо изученных инсуляторов,
обладающих как барьерной, так и блокирующей
энхансеры функциями, расположен на 5’-конце LCR

домена бета-глобиновых генов кур.

 СTCF связывается с рядом известных
инсуляторов и необходим для “enhancer-
blocking” активности
Делеционный анализ инсулятора

enhancer-blocking activity
no bordering activity

no enhancer-blocking activity
bordering activity
 LCR

Ins Ins

Ins
LCR
 Механизм действия инсуляторов остается неясным.
Существующие модели базируются на в равной мере
гипотетических моделях действия энхансеров
Согласно одной из недавно предложенных моделей, окруженный
инсуляторами домен перемещается в активный компартмент ядра,
расположенный рядом с ядерными порами (Laemmli, 2002)