двкзо.

го
УДК 5 7 « v - 3 4 ^

Рецензенты:
зав. кафедрой пищевой биотехноло­ зав. кафедрой технологии микробио­
гии Санкт-Петербургской государствен­ логического синтеза Санкт-Петербург­
ной академии холода и пищевых техно­ ского государственного технологического
логий, член-корреспондент академии хо­ института, академик МАНЭБ Яковлев
лода, профессор Василинец И. М. В. И.

Блинов Н. П.
Е51 Основы биотехнологии. Для студентов институтов;
аспирантов и практических работников. Издательская
фирма "Наука" СПБ 1995 т.е., 600 стр. 166 ил.
ISBN 5-02-026027-4
Книга включает общую и специальную биотехнологии. В ней рассмотрены
объекты и методы, фундаментальные и прикладные аспекты микро-, фито- и
зообиотехнологии, приведены основные биотехнологические процессы получения
различных веществ с помощью микробных, растительных и животных клеток, дана
характеристика оборудования, используемого в конкретной биотехнологии, указа­
ны пути утилизации и обезвреживания плотных и жидких отходов в соответству­
ющих производствах.

ББК 30.16

ISBN 5-02-026027-4 © Издательская фирма "Наука" СПб 1995

 Учителю и организатору первого
в стране инженерно-микробиологи­
ческого факультета при СПХФИ,
з. д. н. РФ, лауреату Государствен­
ной премии проф. Павлу Николаевичу
Кашкину посвящаю свой труд.
Автор
 ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие 7
Введение 9
Часть I.
БИОТЕХНОЛОГИЯ — КАК НАУЧНАЯ ДИСЦИПЛИНА . . 11
ГЛАВА 1. Предмет, история развития, цели и задачи биотехнологии . . . 11
ГЛАВА 2. Объекты и методы биотехнологии 22
2.1. Вирусы 25
2.1.1. Вироиды 26
2.2. Бактерии 27
2.3. Грибы 32
2.4. Растения 36
2.4.1. Водоросли 36
2.4.2. Клетки высших растений 37
2.5. Клетки животных 38
Часть II.
РОЛЬ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
В РАЗВИТИИ БИОТЕХНОЛОГИИ 43
ГЛАВА 3. Фундаментальные исследования в области энзимологии . . . 45
ГЛАВА 4. Фундаментальные исследования в области структурно-
функциональной организации вирусов, клеток и тканей . . . 79
4.1. Акариоты 79
4.2. Клетки прокариот 86
4.3. Клетки эукариот 106
4.4. Некоторые функциональные особенности
клеток и клеточных систем 138
ГЛАВА 5. Фундаментальные исследования в области генетики
и молекулярной биологии вирусов, клеток и клеточных систем 155
5.1. Природа и передача генетической информации 157
5.2. Клонирование генов методами генетической
инженерии; рДНК-биотехнология 177
5.3. Изменчивость организмов и ее значение
в биотехнологии 212
Часть III.
ПРОЦЕССЫ И АППАРАТЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ . . . . 229
ГЛАВА 6. Процессы в биотехнологии 229
6.1. Взаимосвязь процессов и биообъектов 233
6.2. Значение асептики в биотехнологических процессах . . 246
6.3. Борьба с микробами-контаминантами
в биотехнологических производствах . . . . . . . . . 253
6.4. Биотехнологические процессы в связи с массообменом . 261
6.5. Биотехнологические процессы в связи
с особенностями метаболизма клеток 269
6.6. Управление биотехнологическими процессами 275
6.7. Системы GLP и GMP в связи с качеством
биотехнологических продуктов 283
ГЛАВА 7. Техническая вооруженность биотехнологических
производств 288
7.1. Аппаратурное оснащение микробиологических
производств 297
7.2. Некоторые особенности культивирования биообъектов . 306
5
 7.3. Тепловые процессы в ферментаторах • 328
7.4. Аппаратурное оформление процессов выделения '
331
и очистки некоторых продуктов микробного синтеза . •
7.5. Аппаратурное оснащение фитобиотехнологических
производств . . . 341
7.6. Аппаратурное оснащение зообиотехнологических
производств 343
ГЛАВА 8. Отходы биотехнологических производств,
их обезвреживание и утилизация 349
8.1. Обезвреживание отходов биотехнологических
производств 353
8.2. Утилизация отходов биотехнологических производств . . 366
Часть IV.
СПЕЦИАЛЬНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ 373
ГЛАВА 9. Микробиотехнология 374
9.1. Принципы культивирования микроорганизмов 378
9.2. Выделение конечных продуктов ферментации 386
9.3. Микробиотехнологические процессы 392
9.3.1. Получение продуктов брожения 392
9.3.2. Получение органических кислот 411
9.3.3. Получение антимикробных веществ 428
9.3.4. Получение аминокислот 444
9.3.5. Получение витаминов 479
9.3.6. Получение микробных препаратов —
удобрителей почв, стимуляторов и регуляторов
роста растений 455
9.3.7. Получение микробных полимеров 459
ГЛАВА 10. Фитобиотехнология 489
10.1 Термины, используемые в фитобиотехнологии 492
10.2. Вегетативное размножение растений методом
культур тканей 500
10.3. Культивирование клеток растений
в глубинных условиях 507
10.4. Использование методов генетической инженерии,
или рДНК в фитобиотехнологии 510
10.5. Получение биогаза и удобрений на основе
использования растений •. 520
10.6. Коллекционные центры сохранения генофонда
растений 526
ГЛАВА 11. Зообиотехнология 532
11.1. Способы выращивания клеток животных 534
11.2. Эмбриональные и другие ткани для репродукции
вирусов и получения вирусных препаратов 544
11.3. Получение инсектопатогенных вирусов
в клеточных культурах 555
11.4. Интерфероны 556
11.5. Получение и использование гомо-,
гетеро- и синкариотических гибридов 562
11.6. Трансгенные животные 581
11.7. Иммуномодуляторы 587
11.8. Коллекционные центры клеточных культур,
их роль в сохранении генофонда животных организмов 597
Литература ' 599
6 ' . •
 ПРЕДИСЛОВИЕ
Первоначальный вариант этой книги был утвержден Госкомоб-
разованием СССР как учебник для студентов, изучающих биотех­
нологические производства на соответствующих факультетах вы­
сших учебных заведений. Его структура сохранена в прежнем виде.
Весь материал книги подразделен на четыре части. В первой из
них рассмотрены предмет, история развития, цели и задачи био­
технологии; объекты и методы биотехнологии; во второй — роль
фундаментальных исследований в развитии биотехнологии; в
третьей - процессы и аппараты в биотехнологии; техническая
вооруженность биотехнологических производств; отходы биотех­
нологических производств, их обезвреживание и утилизация. В
четвертой части представлено основное содержание микробиотех­
нологии, фитобиотехнологии и зообиотехнологии.
В основу книги положен курс лекций, читаемый автором
студентам биотехнологического факультета Санкт-Петербургского
химико-фармацевтического института в течение последних 8 лет
по утвержденной программе. За это время издан ряд монографи­
ческих работ и пособий биотехнологической направленности, од­
нако до сих пор не опубликован учебник, в котором были бы
объединены микро-, фито- и зообиотехнологии. Первая попытка
такого рода всегда сопряжена с возможными недочетами и несо­
вершенством, поэтому все критические и конструктивные замеча­
ния будут приняты нами с признательностью.
В подготовке 7-й главы учебника активное участие приняли
доценты Р. М. Бакаева и Н. А. Силуянова. При окончательном
оформлении книги учтены пожелания и рекомендации профессо­
ров, доцентов и ассистентов СПХФИ в составе: проф. Г. А.
Витовской, проф. Н. А. Заикиной, доц. В. К. Грековой, доц. М.А.
Кашкиной, доц. Ю. Б. Марюхта, доц. И. П. Соколовой, к. б. н. асе.
С. В. Гуриной; в подготовке рукописи и иллюстративного материала
большую помощь оказали С. В. Волобуева, С. Л. Воротынская, А.
О. Григорянц, Н. Н. Блинова, А. В. Караваева, О. А. Кудряшова, Н.
В. Разукрантова, М. А. Савинова, О. М. Тихомирова, Л. Г. Федорова,
В. В. Южанина. Всем названным лицам выражаю свою искреннюю
благодарность.
Автор также признателен рецензентам проф. И. М. Василинецу
и проф. В. И. Яковлеву.
Издание учебника было бы просто невозможным без велико­
душной спонсорской поддержки директора АП "Новая Заря" Юрия
Федоровича Назарова, чье понимание социальных задач и вера в
7
успех подготовки молодых кадров инженеров-биотехнологов в
России по новейшим направлениям развития науки и техники
явились основным побудительным мотивом содействовать нашим
усилиям.
Публикация книги в настоящем виде осуществлена в сжатые
сроки благодаря умелой организации и благосклонности генераль­
ного директора акционерного объединения "Роспечать" Белгород­
ской области Виктора Васильевича Гончарова, директора Белго­
родской областной типографии Галины Николаевны Левиной,
технического редактора Валентины Степановны Просековой, кор­
ректора Светланы Сергеевны Кухаревой. 7
Заслуженный деятель науки России,
академик СПбИА, проф. Н. П. Блинов—

8
 ВВЕДЕНИЕ
Современный уровень развития биотехнологии обусловлен
общим прогрессом науки и техники, особенно — в течение послед­
них 50 лет. Достаточно отметить лишь такие события, как установ­
ление структуры и функций нуклеиновых кислот, обнаружение
ферментов рестрикции ДНК и выявление их значения в жизни
клеток с последующим использованием в генно-инженерных ра­
ботах, создание гибридом и получение моноклональных антител,
внедрение ЭВМ и компьютерной техники в биотехнологические
процессы и т. д.
Изучение биотехнологии невозможно без знания основ хими­
ческих дисциплин и, прежде всего, органической, биологической
и коллоидной химии, ряда биологических дисциплин (общей био­
логии, микробиологии, ботаники, генетики, иммунологии, эколо­
гии), а также процессов и аппаратов химической и биологической
технологии и ряда других общеинженерных дисциплин.
Биотехнологию относят к числу приоритетных наук, где можно
прогнозировать более быстрые и важнейшие достижения для
социально-экономического прогресса общества.
Ведущее положение в области внедрения биотехнологических
разработок ныне занимают США, где к концу 80-х. годов биотех­
нологическими проблемами было занято 349 компаний, включая
296 — чисто биотехнологических, расходовавших на эти цели,
например, в 1987 г. 1 млрд. 200 млн. долларов. Среди них можно
назвать Genentech Inc., Alza сотр., Amgen Inc., Cetus сотр., Biogen,
Ceptocor Inc., Chiron сотр., Xoma corp., Immunex сотр., DNA Plant
Technology, Celgene сотр., Damon Biotech Inc., и др. При этом
области исследования включали: создание лекарств и диагности­
ческих средств (467 млн. долларов), специальных химических
соединений (144 млн. долларов); животноводство и растениеводст­
во (168 млн. долларов); оборудование (48 млн. долларов) и т. д.
Food and Drug Administration (FDA) в 1982 г. одобрила и
разрешила применение первого биотехнологического продукта —
генно-инженерного инсулина; в последующие годы было разреше­
но применять еще 8 биотехнологических препаратов: два варианта
гормона роста человека, два варианта 2ос-интерферона для лечения
волосатоклеточной лейкемии, активатор тканевого плазминогена
(ТРА) для лечения тромбоза коронарных сосудов, вакцину против
гепатита В, фактор VIII для лечения гемофилии, мышиные моно-
клональные антитела для предупреждения отторжения почечных
трансплантатов.
9
 К 1988 г. в США свыше 80 лекарственных веществ и вакцин
были объектами биотехнологических разработок, 14 и з которых
были представлены на утверждение в FDA: тромболитические
агенты; ферменты дисмутазы, предупреждающие клеточные по­
вреждения, наступающие при реперфузии гипоксических тканей;
гормон эритропоэтин, стимулирующий эритропоэз; эпидермаль-
ный ростовой фактор для ускоренного заживления ран; монокло-
нальные антитела для трансплантации костного мозга, лечения
септического шока, рака и патологических состояний от передо­
зировок лекарств и др. (к 1988 г. было одобрено 300 наборов
моноклональных антител). К 1995 г. стоимость поступающих на
рынок только моноклональных антител прогнозировалась в 6,4
биллиона долларов.
Из научных учреждений России ведущее место по биотехно­
логии занимает институт биохимии и физиологии микроорганиз­
мов РАН (ИБФМ), сотрудники которого, например, совместно с
учеными научно-исследовательского вычислительного центра
(НИВЦ) в 1985 г. создали автоматизированный комплекс "Фермен­
тер-ЭВМ", что обеспечивает возрастание эффективности управле­
ния процессом биосинтеза; существенный вклад в решение био­
технологических проблем в России внесли коллективы ВНИИ
"Синтез-белок", ВНИИ биотехнологии, ВНИИА, Сибирское отде­
ление РАН, институт молекулярной биологии РАН, институт гене­
тики и селекции промышленных микроорганизмов и др.
В России давно и хорошо известны предприятия, выпускающие
биотехнологическую продукцию (антибиотики, ферменты, различ­
ные дрожжи и т. д.). Это ж е можно сказать и о предприятиях в
странах СНГ.
Основной вклад в подготовку кадров инженеров-биотехнологов
с 1945 г. вносил и продолжает вносить Санкт-Петербургский
химико-фармацевтический институт; с начала 80-х годов подготов­
ка таких специалистов была расширена за счет открытия новых
биотехнологических отделений и факультетов в других вузах
страны. Сегодня изучение биотехнологии является "велением вре­
мени" для высших и средних специальных учебных заведений, в
которых подготавливаются молодые специалисты для соответству­
ющих отраслей производства. Объем и программы курсов могут
варьировать в зависимости от профилизации учебного заведения.
В настоящем издании, по возможности, затронуты все основные
аспекты биотехнологии, и поэтому эта книга может быть исполь­
зована также и сотрудниками учреждений^ призванных выпускать
биотехнологическую продукцию.
ю
 Часть I
Биотехнология —
как научная дисциплина
Глава 1
ПРЕДМЕТ, ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ,
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ БИОТЕХНОЛОГИИ
Биотехнология — это наука об использовании биологических
процессов в технике и промышленном производстве. Название ее
происходит от греческих слов bios — жизнь, teken — искусство,
logos — слово, учение, наука. К числу биологических процессов
и
относят те из них, в которых применяют биологические объекты
различной природы (микробной, растительной или животной),
например, производство ряда продуктов медицинского, пищевого
и другого назначения — антибиотики, вакцины, ферменты, кор­
мовой и пищевой белки, полисахариды, гормоны, гликозиды, ами­
нокислоты, алкалоиды, биогаз, удобрения и пр.
В соответствии с определением Европейской Федерации Био­
технологов (ЕФБ, 1984) биотехнология базируется на интегральном
использовании биохимии, микробиологии и инженерных наук в
целях промышленной реализации способностей микроорганизмов,
культур клеток тканей и их частей. Уже в самом определении
предмета отражено его местоположение как пограничного, благо­
даря чему результаты фундаментальных исследований в области
биологических, химических и технических дисциплин приобрета­
ют выраженно прикладное значение. Биотехнология непосредст­
венно связана с общей биологией, микробиологией, ботаникой,
зоологией, анатомией и физиологией, биологической, органиче­
ской, физической и коллоидной химией, иммунологией, биоинже­
нерией, электроникой, технологией лекарств, генетикой и другими
научными дисциплинами.
Человек, рождающийся для познания мира (в том числе — и
самого себя), давным-давно освоил на практике различные процес­
сы биотехнологии, не зная по существу, что они относились к
такому разряду. В самом деле, с библейских времен известно
виноделие, тысячелетия насчитывает хлебопечение и т. д.
Познавательная деятельность людей непосредственно сказыва­
лась на уровне социального развития общества. Недаром вторую
половину XX столетия мы называем периодом научно-технической
революции. Наука сегодня имеет огромное значение в жизни
людей, и научный подход к решению любой задачи — веление и
требование времени.
Наука формировалась и эволюционировала по мере формиро­
вания и развития человеческого общества. Это, в частности, не­
посредственно относится и к биотехнологии. Ее возникновение,
становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода:
эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехниче-
ский. Эмпирический (от греч. empeirikos — опытный) или доисто­
рический период — самый длительный, охватывающий примерно
8000 лет, из которых более 6000 лет — до нашей эры и около 2000
лет — нашей эры. Древние народы того времени интуитивно
использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и
12
некоторых других продуктов, которые теперь мы относим к раз­
ряду биотехнологических. Кризис охотничьего промысла (хозяй­
ства) стал побудительным мотивом революции в изготовлении
продуктов питания. Эта революция началась около 8000 лет назад
и привела к изобретению техники земледелия — началу произво­
дительного ведения хозяйства (неолит и бронзовый века.) Стали
формироваться так называемые приречные цивилизации Месопо­
тамии, Египта, Индии и Китая. Шумеры — первые жители Месо­
потамии (на территории современного Ирака) создали цветущую
в те времена цивилизацию. Они выпекали хлеб из кислого теста,
владели искусством готовить пиво. В этом следовали им ассирийцы
и вавилоняне, жившие также в Месопотамии, египтяне и древние
индусы. В течение нескольких тысячелетий известен уксус, издрев­
ле приготавливавшийся в домашних условиях, хотя о микробах —
индукторах этого процесса мир узнал в 1868 г. благодаря работам
Пастера, и это несмотря на существование с XIV в. так называемого
"Орлеанского способа" приготовления уксуса; первая дистилляция
вина осуществлена в XII в.; водку и з хлебных злаков получили в
XVI в.; шампанское известно с XVIII в., но получение почти
абсолютного этанола впервые удалось в XIV в. испанцу Раймунду
Луллию (ок. 1235 — 1315) благодаря перегонке вина с негашеной
известью.
В те древние времена продукты питания растительного и
животного происхождения использовались не только в пищу, но
и для лечебных целей. Например, в ассирийской столице Ниневии
(8 — 7 века до н. э.) была царская библиотека, насчитывавшая
более 30 000 клинописных табличек, из которых в 33 имелись
сведения о лекарственных средствах и их рецептуре, и в самом
городе размещался сад лекарственных растений.
К| тому ж е эмпирическому периоду относятся: получение кис­
ломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных
напитков, силосование кормов, мочка лубоволокнистых растений.
Длительное накопление фактов происходило и в области ми­
кологии (от греч. myxes — гриб). Сведения о грибах можно найти
в писаных источниках древности, а Луций Лициний Лукулл (106
— 56 гг. до н. э.), славившийся богатством, роскошью и пирами("лу-
куллов пир"), предпочитал всем съедобным грибам кесарев гриб
(Amanita cesarea, L.). Древние евреи хорошо знали ржавчину
хлебных злаков и головню. В IV — I веках до н. э. были собраны
интересные материалы о грибах, нашедшие отражение в работах
Аристотеля, Диоскорида, Плиния Младшего, Теофраста. В после-
13
дующие века нашей эры микология стала самостоятельной наукой
— велика роль в этом Д. Персоона и Э. М. Фриза, по праву
считающихся отцами систематической микологии.
Таким образом, народы исстари пользовались на практике
микробиологическими процессами, ничего не зная о микробах.
Эмпиризм также был характерен и в практике использования
полезных растений и животных.
Второй, этиологический (от греч. aitia — причина) период в
развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX века и
первую треть XX века (1856 — 1933 гг.). Он связан с выдающимися
исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (1822
— 1895) — основоположника научной микробиологии и ряда
микробиологических дисциплин (промышленной, медицинской,
химической, санитарной). С аналитической микробиологией не­
посредственно связано открытие Пастером молекулярной ассимет-
рии (стереоизомерии). Это, по существу, бриллиантовый век мик­
робиологии. Пастер вскрыл микробную природу брожений, дока­
зал возможность жизни в бескислородных условиях, эксперимен­
тально опроверг ходячее тогда представление о самопроизвольном
зарождении живых существ, создал научные основы вакцинопро-
филактики и вакцинотерапии; предложил метод стерилизации,
называемый по его имени пастеризацией и т. д.
Немеркнущая слава Пастера не затмила имен его выдающихся
учеников и сотрудников: Э. Дюкло, Э. Ру, Ш. Э. Шамберлана, Ж .
А. Вильемена, И. И. Мечникова. В этот ж е период творили Р. Кох,
Д. Листер, Ш. Китазато, Г. Т. Риккетс, Д. И. Ивановский, А. Лаверан
и другие.
Параллельно с Пастером трудился в Германии, а позднее — во
Франции, выдающийся миколог А. де Бари (1831 — 1888) —
основоположник физиологической микологии. Изучив стадии раз­
множения и историю индивидуального развития грибов (онтоге­
нетический метод), с учетом их взаимоотношений с другими
видами, а также цитологических и биологических особенностей,
де Бари создал классификацию, которая и сегодня лежит в основе
современных классификационных схем микро- и макромицетов.
Де Бари — основоположник микофитопатологии — науки о
грибных болезнях растений (от греч. fiton — растение, pathos —
болезнь), под его руководством сформироваласьплеядавыдающих-
ся ученых (в том числе — из России): Ф. М Бальфур, И. В.
Баранецкий, М. Бейеринк, О. Брефельд, М. С. Воронин, А. Кох, А.
С. Фаминицин и др.
14
 В биотехнологии важными являются питательные среды для
культивирования ряда биообъектов. Уже Л. Пастер приготовил
первую жидкую питательную среду в 1859 году, метод выращива­
ния грибов на желатине предложил О. Брефельд в 1864 г., Ж. Ролен
сообщил о жидких средах для выращивания нитчатых грибов в
1870 г., Р. Коху в 1876 г. удалось вырастить бациллы сибирской
язвы в капле водянистой влаги, извлеченной из глаза погибшей
коровы. В 80-е годы XIX столетия Р. Кох предложил метод культи­
вирования бактерий на стерильных ломтиках картофеля и затем
— на агаризованных питательных средах.
В настоящее время, предлагая самые сложные и необычные в
каком-либо отношении среды для выращивания биообъектов, мы
опираемся на основополагающие результаты этих выдающихся
ученых. Аналогичным образом можно сказать и о вариантах
способов стерилизации питательных сред, имея в виду тиндализа-
цию, кипячение, дробную стерилизацию и др. Все они основыва­
лись на необходимости уничтожения посторонней микрофлоры,
которая попадала в среды в процессе их изготовления.
В ряду открытий всемирного значения стоит обнаружение в
1892 г. вируса мозаичной болезни табака Д. И. Ивановским (1864
— 1920). Последовавшие за этим обнаружения других вирусов
обеспечили становление новой научной дисциплины — вирусоло­
гии: Ф. Леффлер и П. Фрош в 1898 г. открыли вирус ящура, Д.
Кэррол в 1901 г. — вирус желтой лихорадки, ф. Туорт в 1915 г. и
Ф. д'Эрелльв 1917 г. — вирусы бактерий (бактериофаги). Большой
вклад в вирусологию был внесен отечественными и зарубежными
учеными — Л. А. Зильбером, А. А. Смородинцевым, М. П. Чума­
ковым, А. Борелем, К. Левадити, К. Ландштейнером, В. Стэнли, П.
Лейддоу, П. Руа, П. Ф. Эндерсом и многими другими-
Этиологический период знаменателен тем, что удалось доказать
индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах.
Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах
и использован в целях воспроизведения соответствующих процес­
сов (бродильных, окислительных и др.). Например, маслянокислые
бактерии и вызываемое ими маслянокислое брожение, лактобак-
терии и молочнокислое брожение, дрожжи — сахаромицеты и
спиртовое брожение, уксуснокислые бактерии и окисление этано­
ла до уксусной кислоты и т. д. В этот период было начато
изготовление прессованных пищевых дрожжей, а также некото­
рых продуктов обмена (метаболизма) — ацетона, бутанола, лимон­
ной и молочной кислот; во Франции приступили к созданию
15
биоустановок для микробиологической очистки сточных вод.
Знание причин биологических процессов еще не исключало
нестерильные операции, хотя и стремились к использованию
чистых культур микроорганизмов.
Для всестороннего изучения морфолого-физиологических
свойств и продуктов обмена, прежде всего, микробов все ранее
предложенные способы их выращивания оказались малопригод­
ными. Более того, накопление однородной по возрасту большой
массы клеток оставалось исключительно трудоемким процессом.
Вот почему требовался принципиально иной подход для решения
многих задач в области биотехнологии. В 1933 году А Клюйвер и
Л. X. Ц. Перкин опубликовали работу "Методы изучения обмена
веществ у плесневых грибов", в которой изложили основные
технические приемы, а также подходы к оценке и интерпретации
получаемых результатов при глубинном культивировании грибов.
С этого времени начинается третий период в развитии биологи­
ческой технологии — биотехнический. Началось внедрение в
биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудо­
вания, обеспечившего проведение процессов в стерильных усло­
виях. Особенно мощный толчок в развитии промышленного био­
технологического оборудования был отмечен в период становления
и развития производства антибиотиков (время второй мировой
войны 1939 — 1945 гг., когда возникла острая необходимость в
противомикробных препаратах для лечения больных с инфициро­
ванными ранами). Все прогрессивное в области биологических и
технических дисциплин, достигнутое к тому времени, нашло свое
отражение в биотехнологии. Следует отметить, что уже в 1869 г.,
Ф. Мишер получил "нуклеин" (ДНК) из гнойных телец (лейкоци­
тов); В. Оствальд в 1893 г. установил каталитическую функцию
ферментов; Т. Леб в 1897 г. установил способность к выживанию
вне организма (в пробирках с плазмой или сывороткой крови)
клеток крови и соединительной ткани; Г. Хаберланд в 1902 г.
показал возможность культивирования клеток различных тканей
растений в простых питательных растворах; Ц. Нейберг В 1912 г.
раскрыл механизм процессов брожения; Л. Михаэлис и М. Л.
Ментен в 1913 г. разработали кинетику ферментативных реакций,
а А. Каррел усовершенствовал способ выращивания клеток тканей
животных и человека и впервые применил экстракт эмбрионов
для ускорения их роста; Г. А. Надсон и Г. С. Филлипов в 1925 г.
доказали мутагенное действие рентгеновских лучей на дрожжи, а
в 1937 г. Г. Кребс открыл цикл трикарбоновых кислот (ЦТК); в 1960
16
г. Ж. Барски и др. впервые обнаружили соматические гибриды
опухолевых клеток мыши. Следовательно, накопленные научные
факты стали побудительным мотивом для разработки способов
крупномасштабного культивирования клеток различного проис­
хождения. Это.необходимо было для получения различных клеточ­
ных продуктов и самих клеток для нужд человека, и, прежде всего,
в качестве или в составе лечебных и профилактических средств:
пенициллина, стрептомицина, тетрациклинов, декстрана, ряда ами­
нокислот и многих других веществ. К 1950 г. Ж. Моно (Франция)
разработал теоретические основы непрерывного управляемого
культивирования микробов; в 50-е годы вопросам практической
реализации непрерывного культивирования микроорганизмов по­
святили свои исследования М. Стефенсон, И. Малек, Н. Д. Иеру­
салимский и др.
Примерно за 40 лет третьего периода были решены основные
задачи по конструированию, созданию и внедрению в практику
необходимого оборудования, в том числе главного из них —
биореакторов. Это оборудование используют и в настоящее время.
Четвертый период в биотехнологии — генотехнический (от
греч. genesis — происхождение, возникновение, рождение) начал­
ся с 1972 г. В этом году П. Берг со своими сотрудниками в США
создали первую рекомбинантную молекулу ДНК. Однако следует
отметить, что в 1969 г. Дж. Бекуит с коллегами выделил в химически
чистом виде лактозный ген из кишечной палочки, показав тем
самым возможность направленных манипуляций с генетическим
материалом бактерий.
Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж.
Уотсона (1953) по установлению структуры ДНК было невозмож­
ным достигнуть современных результатов в области биотехноло­
гии. Выяснение механизмов функционирования и регуляции ДНК,
выделение и изучение специфичных ферментов привело к фор­
мированию строго научного подхода к разработке биотехнологи­
ческих процессов на основе генно-инженерных работ. В этом суть
генотехнического периода.
Уже в 1982 г. поступил в продажу человеческий инсулин,
выработанный кишечными палочками, несущими в себе искусст­
венно встроенную генетическую информацию об этом гормоне.
На таком же уровне или с близким к тому заделом находятся
следующие генно-инженерные препараты: интерфероны, фактор
некротизации опухоли (TNF), интерлейкин-2, соматотропный гор­
мон человека и аналог его соматомеднн Ц и другие^ _ _ , '" •"""**"
] 7 I f . Я " •":.::'• А
i ;:..-,-•;-.- :• L :, '..-'/•' - т с •: н и о й
•-;.,,;:,, '•... с i '.'.':;. с к о й л " , л ;л хл-м
 Зная строение аппарата наследственности у разных организ­
мов, удается манипулировать не только нуклеиновыми кислотами,
но и целыми хромосомами (хромосомная инженерия) и клетками
(клеточная инженерия).
Для генотехнического периода характерны: разработка интен­
сивных процессов (вместо экстенсивных) на основе направленных
фундаментальных исследований (с продуцентами антибиотиков,
ферментов, аминокислот, витаминов), получение суперпродуцен­
тов; создание продуцентов, несущих в себе бессмысленную гене­
тическую информацию (например, гены интерферона человека в
клетках Pseudomonas aeruginosa); создание необычных организ­
мов, ранее не существовавших в природе (неклубеньковых расте­
ний, несущих гены азотобактерий, ответствейные за способность
фиксировать молекулярный азот из воздуха); разработка и внед­
рение экологически чистых и, по возможности, безотходных тех­
нологий; разработка и внедрение в практику специальной аппара­
туры блочного (сменного) типа для различных биотехнологических
схем; автоматизация и компьютеризация биотехнологических про­
цессов; создание экономически оптимальных производственных
процессов при максимальном использовании сырья и минималь­
ном потреблении энергии. Вот почему инженер — биотехнолог в
современном пониманикгдолжен быть широко и глубоко подготов­
ленным специалистом, в распоряжении которого оказываются
сложнейшие биологические системы (или аналоги их), синхронно
работающие в заданном направлении. В любом биотехнологиче­
ском процессе наиважнейшим звеном является биообъект, "кап­
ризы" которого по любому поводу могут пагубно сказаться на
результатах этого процесса.
В течение последних 10 — 15 лет текущего столетия происхо­
дило бурное развитие биотехнологии, определились сферы при­
оритетного внедрения конкретных результатов биотехнологиче­
ских разработок, и, как следствие, появились такие названия, как
медицинская биотехнология, иммунобиотехнология (от лат.
immunus — невосприимчивый), биогеотехнология (от греч. део —
земля), инженерная энзимология (от греч. en — в, zyme — заква­
ска) . ОДНИ из них прочно входят в лексикон специалистов, напри­
мер, иммунобиотехнология, инженерная энзимология, другие на­
звания приживаются плохо или с трудом (медицинская биотехно­
логия, биогеотехнология). К м е д и ц и н с к о й биотехнологии
относили те производственные процессы, которые завершались
созданием с помощью биообъектов средств или веществ медицин­
ского назначения (прежде всего профилактического или лечебного
18
действия на организм человека). Это — антибиотики, некоторые
витамины, коферменты и ферменты, отдельные микробные пол­
исахариды — как самостоятельные препараты или вспомогатель­
ные вещества при создании различных лекарственных форм,
аминокислоты, нуклеозиды и др.
И м м у н о б и о т е х н о л о г и я объединяет производства
вакцин, иммуноглобулинов крови, иммуномодуляторов, иммуно-
медиаторов, моноклональных антител и некоторых других. Можно
заметить, что на основе иммунобиотехнологических процессов
создаются также профилактические и лечебные средства, объеди­
няемые под эгидой медицинской биотехнологии. Следовательно
иммунобиотехнология представляется здесь частным случаем ме­
дицинской биотехнологии. Вместе с тем, иммунобиотехнологиче-
ские процессы по целевым продуктам вышли за пределы медицин­
ского назначения (например, в иммуноферментном анализе, им-
муноблотинге). В равной мере большинство ферментов (как и
аминокислот или некоторых других продуктов) производится не
для целей здравоохранения. Поэтому термин "Медицинская био­
технология" представляется во многом искусственным и, очевидно,
отсюда плохо приживающимся. Напротив, вычленение иммуноби-
отехнологии в качестве самостоятельной научной субдисциплины
является обоснованным, и производственные процессы здесьчетко
ограничены использованием иммунной системы того или иного
макроорганизма или отдельных компонентов ее (макрофаги, лим­
фоциты, различные иммуноглобулины).
Б и о г е о т е х н о л о г и я — это субдисциплина, ранее
называвшаяся геологической микробиологией. Сущность ее сво­
дится к использованию микроорганизмов для добычи полезных
ископаемых, например, цветных металлов, нефти; для окисления
метана в угольных шахтах и пр. Спектр биогеотехнологических
производственных процессов невелик, но очень важен для жизне­
обеспечения народного хозяйства. Необходимо подчеркнуть, что
не все процессы, относимые ныне к биогеотехнологическим, яв­
ляются сугубо технологическими (например, окисление метана с
помощью специальных микроорганизмов). Обычно принято счи­
тать, что в результате биотехнологического процесса образуется
какой-то целевой продукт, используемый на практике. В приведен­
ном примере окисления метана преследуется иная цель — сниже­
ние концентрации метана до безопасного (например, для шахте­
ров) уровня. Хотя и в этой реакции образуются конечные продук­
ты, которые могут быть использованы на практике:
С Щ + 0 2 — • СО2 + 2Н 2
19
 И н ж е н е р н а я э н з и м о л о г и я — это отрасль
биотехнологии, базирующаяся на использовании каталитических
функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном
состоянии или в составе живых клеток для получения соответст­
вующих целевых продуктов. Биообъект здесь — фермент (или
комплекс ферментов). На практике обычно используют иммоби­
лизованные ферменты (реже — иммобилизованные клетки), бла­
годаря чему стабилизируется и пролонгируется их ферментативная
-активность. Иногда инженерную энзимологию отождествляют с
биотехнологией. В этом содержится большая доля истины, так как
все реакции в клетках катализируются ферментами. Однако слово
"инженерная" привносит свою специфику, заключающуюся в
акценте на создание конструкции (от франц. engin — машина), в
данном случае — на конструирование биокатализаторов с задан­
ными свойствами с последующим использованием в биотехноло­
гическом процессе.
В научной литературе можно встретить и другие названия
биотехнологических процессов, например, "Биотехнология живо­
тной клетки", "Экономическая микробиология", "Ферментация и
биоинженерия", "Промышленная микробиология", "Сельскохозяй­
ственная биотехнология", "Биохимическая инженерия" и др. Более
того, в принципе можно говорить и писать о биотехнологии
каждого индивидуального продукта, образуемого каким-либо мик­
робом, какими-либо клетками растений и животных, или появля­
ющегося под каталитическим воздействием фермента; в равной
мере речь может идти и о биотехнологии продуцентов каких-либо
веществ, например, о Panax ginzeng (жень-шень), о Rauwolfia
serpentina (Раувольфия змеевидная), об Actinomyces spp. (актино-
мицеты) и т. д. Поэтому наиболее рациональным является подраз­
деление биотехнологии на микробную биотехнологию, раститель­
ную, или фитобиотехнологию, и животную, или зообиотехноло-
гию, включающую также и биотехнологические процессы, осно­
ванные на использовании клеток человека.
Из приведенной схемы видно, что наибольшее число реализо­
ванных процессов имеет место в микробной биотехнологии. Мно­
гие микроорганизмы обладают заметным преимуществом перед
растительными и животными объектами по таким показателям,
как скорость размножения, лабильность и быстрота адаптации к
изменяющимся условиям среды обитания. Этим и определяется
диапазон применения микробов в различных отраслях производ­
ственной деятельности человека, то есть все то, что составляет
20
 I Биотехнология .
I " •. | I
микробиотехнология фитобиотехиология зообиотехиология
использование
в легкой в агропромышленном в животноводстве,
промышленности, в комплексе, в медицинской
пищевой в медицинской и промышленности,
промышленности, косметической в пищевой
в медицинской промышленности промышленности
промышленности,
в химической
промышленности,
в металлургии,
в нефтедобывающей
промышленности,
в водном хозяйстве,
в защите окружающей
среды,
в энергетике,
в косметической
промышленности

предмет "Промышленная микробиология". Это можно представить

в следующем виде (таблица 1).
Какие же основные цели и задачи стоят перед биотехнологами?
Во-первых, поддержание и активация путей обмена клеток, веду­
щих к накоплению целевых продуктов при заметном подавлении
других реакций обмена у культивируемого организма; во-вторых,
получение клеток или их составных частей (преимущественно —
ферментов) для направленного изменения сложных молекул (на­
пример, рестриктазы, изомеразы и т. д.); в-третьих, углубление и
совершенствование рДНК-биотехнологии и клеточной инженерии
на предмет получения особо ценных результатов в фундаменталь­
ных и прикладных разработках; в-четвертых, создание безотход­
ных и экологически безопасных биотехнологических процессов;
в-пятых, совершенствование и оптимизация аппаратурного офор­
мления биотехнологических процессов с целью достижения мак­
симальных выходов конечных продуктов при культивировании
естественных видов с измененной наследственностью методами
клеточной и генной инженерии; в-шестых, повышение технико-
экономических показателей биотехнологических процессов по
сравнению с существующими.
21
Таблица 1. Процессы в промышленной микробиологии

Характеристика Целевые продукты -ч

процесса Названия целевых
Биосинтез Метаболиты: продуктов или процессов
Аминокислоты |
преметаболиты Нуклеозиды
Нуклеотиды
первичные Нуклеиновые кислоты
Ферменты
вторичные Алкалоиды
Антибиотики
Гиббереллины
Гликаны и гликоконъюгаты 1
Органические кислоты,
кетоны, спирты,
Липиды
Аминокислоты, пептидные
гормоны
Клеточная масса Пекарские и пивные д р о ж ж и
Кормовой и пищевой белок
Вакцины и антигенные вещества
Трансформация Неорганические Обнаружение металлов
вещества Обогащение металлов
Преимущественно Компостирование отходов,
органические получение биогаза |
вещества Детоксикация, дезодорация
и обезвреживание, например,
ПАВ (поверхностно-активных в-в)
Определение (анализ) веществ по
продуктам трансформации
Кисломолочные продукты и сыры
Хлебно-булочные изделия
Квашение и соление овощей
Силосование кормов
Мочка льна и джута
Ферментация чая, табака, кофе,
какао, маслин
Пивоварение, виноделие,
винокурение

Глава 2
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы
— микромицеты и макромицеты, протозоиные организмы, клетки
22
(ткани) растений, животных и человека, некоторые биогенные и
функционально сходные с ними вещества (например, ферменты,
простагландины, лектины, нуклеиновые кислоты и др.). Следова­
тельно, объекты биотехнологии могут быть представлены органи­
зованными частицами (вирусы), клетками (тканями) или их мета­
болитами (первичными, вторичными). Даже при использовании
биомолекулы как объекта биотехнологии исходный биосинтез ее
осуществляется в большинстве случаев соответствующими клет­
ками. В этой связи можно сказать, что объекты биотехнологии
относятся либо к микробам, либо к растительным и животным
организмам. В свою очередь организм можно образно характери­
зовать как систему экономного, сложнейшего, компактного, само­
регулируемого и, следовательно, целенаправленного биохимиче­
ского производства, устойчиво и активно протекающего при оп­
тимальном поддержании всех необходимых параметров. Из такого
определения следует, что вирусы не являются организмами, но по
содержанию молекул наследственности, приспособляемости, из­
менчивости и некоторым другим свойствам они относятся к пред­
ставителям живой природы.
Как видно из приводимой схемы, объекты биотехнологии
исключительно разнообразны, диапазон их распространяется от
организованных частиц (вирусов) (рис. 1А) до человека.
Вирусы занимают положение между живой и неживой приро­
дой, у них нет ядра, хотя имеется наследственный ядерный мате­
риал — рибонуклеиновая кислота (РНК) или дезоксирибонуклеи-
новая кислота (ДНК).
В отличие от микробов клеточной организации РНК и ДНК в
вирусных частицах вместе никогда не обнаруживаются.
Из сказанного следует, что названия "биологическая техноло­
гия, или биотехнология" и "биохимическая технология" тождест­
венны, так как биологические процессы, используемые в технике
и промышленном производстве, базируются на биохимической
основе.
В настоящее время большинство объектов биотехнологии со­
ставляют микробы, относящиеся к трем надцарствам (безъядер­
ные, предъядерные, ядерные) и пяти царствам (вирусы, бактерии,
грибы, растения и животные). Причем первые два надцарства
состоят исключительно из микробов, тогда как третье — преиму­
щественно из растений и животных.
23
 Безъядерные Предъядерные Ядерные
(Acaiyotae) (Procaryotae) (Eucaryotae)

Царства
I
Вирусы Бактерии Грибы
(Vira) (Bacteria) (Mycota)

Растения
(Plantes).

Животные
(Animalia)

М о р ф о л о г и ч е с к а я э л е м е н тар н а я
единица

Неклеточная
организованная Клетка Клетка
частица

Тип с о д е р ж а щ е й с я н у к л е и н о в о й
к и с л о т ы - ДНК и / и л и РНК

ДНК или РНК ДНК и РНК ДНК и РНК

(никогда вместе)

Микробами среди растений являются микроскопические водо­

росли (Algae), а среди животных — микроскопические простейшие
(Protozoa). Из эукариот к микробам относятся грибы и, при опре­
деленных оговорках, лишайники, которые являются природными
симбиотическими ассоциациями микроскопических грибов и мик­
роводорослей или грибов и цианобактерий.
В первой половине XIX в. было сделано одно из самых основных
обобщений биологии — клеточная теория (М. Шлейден, Т. Шванн,
Р. Вирхов), которая стала общепризнанной. Она же оказалась
фундаментом науки — цитология (от греч. kitos — полость). Из
всех объектов биотехнологии лишь вирусы, вироиды и биомоле­
кулы не имеют клеточной организации. Однако вирусы, находясь
в клетках, ведут себя как живые существа — они реплицируются
("размножаются") и их генетический материал функционирует, в
24
. основном^ по общим законам, присущим клеткам любого проис­
хождения. По мере совершенствования методов' и техники цито­
логических исследований ученые глубже проникают в сущность
организованных частиц и клеток, а в результате такого проникно­
вения удается обосновать принадлежность всех живых существ к
трем надцарствам: Acaryotae — безъядерные, Procaryotae — предъ-
ядерные и Eucaryotae — ядерные (от греч. а — нет, pro — до, ей
— хорошо, полностью, karyon — ядро). К первому относятся
организованные частицы — вирусы и вироиды, ко второму —
бактерии, к третьему — все другие организмы (грибы, водоросли,
растения, животные).
Несмотря на то, что представители всех надцарств содержат
генетический материал, различные акариоты лишены какого-либо
одного типа нуклеиновой кислоты РНК или ДНК. Они не способны
функционировать (в том числе — реплицироваться) вне живой
клетки, и, следовательно, правомочно именовать их безъядерными.
Бактерии имеют клеточную организацию и у них имеются
нуклеиновые кислоты обоих типов — РНК и ДНК, из которых ДНК
представлена в виде одиночной (кольцевидной) хромосомы. Боль­
шинство из них размножается на питательных средах (вне орга­
низма), а если среди бактерий и есть безусловные (облигатные)
паразиты, приближающиеся по данному признаку к вирусам (хла-
мидии, спироплазмы, риккетсии), то паразитизм их отличается по
своему механизму — его можно назвать клеточным. Паразитизм
вирусов развивается на генетическом уровне. Таким образом,
бактерии — это организмы, состоящие из функционально связан­
ных структур, в том числе, генетических. Несмотря на то, что
генетические структуры бактериальной клетки функционируют
полноценно, они не сгруппированы в форме отграниченного ядра,
и поэтому бактерии отнесены к предъядерным (прокариотическим)
организмам.
Клетки грибов,-водорослей, растений и животных имеют на­
стоящее, отграниченное от цитоплазмы, ядро и поэтому их относят
к эукариотам.
2.1. В и р у с ы . Среди микробов вирусы характеризуются
наименьшей величиной — они измеряются в нанометрах (нм.), и
облигатным паразитизмом. Последний признак положен в основу
классификации их на вирусы бактерий, или бактериофаги, вирусы
растений и вирусы животных; имеются также и вирусы грибов.
Как уже было сказано, структурно вирусы представляют собой
организованные частицы, содержащие один какой-либо тип нук­
леиновой кислоты (РНК или ДНК), не обладающие собственным
25
обменом веществ, но способные к репликации в клетках организ­
ма-хозяина или интеграции с его геномом, ведя при этом "скрытое
существование". Под организованностью вирусной частицы пони­
мают специфическое построение, или архитектонику (от греч, archi
— начальный, главный, первый, tecton — искусник, мастер) струк­
турных блоков, характерную для того или иного вируса, сущест­
вующего вне организма — в и р и о н (см. рис. 22а). Каждый вирион
в очищенном виде представляет собой истинный кристалл, кото­
рый построен из нуклеиновой кислоты и белка, не связанных друг
с другом ковалентными связями. Понятие "вирион" относится к
интактной вирусной частице (от лат. intactus — нетронутый,
неповрежденный), способный к инфицированию или заражению
(от лат. infectiosus — заразный).
Нуклеиновые кислоты — вещества наследственности вирусов.
По типу нуклеиновой кислоты их подразделяют на РНК-содержа-
щие вирусы и ДНК-содержащие вирусы. К первым относят все
вирусы растений, ко вторым — большинство бактериофагов, ряд
вирусов человека и животных (аденовирусы, вирусы герпеса,
осповакцины и др.).
Белок структурируется вокруг вирусной нуклеиновой кислоты
(генома) в виде оболочки и называется к а п с и д о м . Форма
вириона определяется его капсидом. Вместе с нуклеиновой кисло­
той капсид образует н у к л е о к а п с и д .
Примерный перечень вирусов включает 17 семейств вирусов
позвоночных и 7 семейств вирусов беспозвоночных животных, 10
семейств вирусов бактерий. Описаны 20 родов вирусов растений
и 5 родов вирусов грибов. Классификационные схемы вирусов до
конца еще не устоявшиеся, к тому же открывают новые для науки
вирусы (пример с вирусами эбола, иммунодефицита человека —
ВИЧ). Представителями ДНК-содержащих вирусов являются ви­
русы контагиозного моллюска, оспы, герпеса, большинство фагов
бактерий; РНК-содержащими являются вирусы растений, вирусы
гриппа человека, бешенства, полиомиелита и др.
2.1.1. В и р о и д ы . В 1971 г. Т. О. Динер (США) впервые описал
субвирусный возбудитель (патоген) веретеновидности клубней
картофеля (ВВКК), названный вироидом. К 1984 г. было известно
10 болезней культурных растений (в том числе — зерновых),
вызываемых вироидами. По молекулярной структуре вироиды
представляют собой одноцепочечные, ковалентно замкнутые, коль­
цевые молекулы РНК, лишенные капсидов. Число нуклеотидов в
таких РНК находится в пределах 240 — 400. По форме вироиды
26
могут быть линейные и кольцевидные, они способны принимать
шпилечную, квазидвухцепочечную конформацию (от лат. quasi —
якобы, как-будто, почти, близко; conformatio — форма, расположе­

ний" . :«S* .
•та -0т. ф&. , & ,J

• • « ,

Рис. 1. Бактериофаг Т2(А):1 — капсомеры, по­

крывающие головку, 2— воротничок, 3 — шей­
ка, 4 — полый стержень, 5 — чехол, 6 — нити,
7 — икосаэдрическая головка; мендсикуты Б (а-
д): галобактерии (а), метанобактерии (б), вегета­
тивные формы (в) и покоящиеся формы (г);
термоацидофилы (д); тенерикуты (е): микоплаз-
мы (ж), спироплазмы (з).
ние). Каждый тип вироида, например ВВКК или вироид экзокор-
тиса цитрусовых (ВЭЦ), содержит уникальный, только ему прису­
щий, особый вид низкомолекулярной РНК. Размеры вироидов
находятся в пределах 15 нм. В чувствительных клетках растений-
хозяев они сосредоточиваются в ядре, ассоциируясь с ядрышком
в виде белково-нуклеинового комплекса, и реплицируются авто­
номно-целиком при помощи предсуществующих или активирован­
ных ферментов хозяина. Вироиды не транслируются! Это подтвер­
ждается структурным сходством их между собой и отсутствием у
ряда вироидов кодонов-инициаторов. В то же время репликация
происходит благодаря транскрипции последовательностей вироид-
ных РНК с РНК-матриц при участии РНК-полимераз.
2.2. Б а к т е р и и — существа клеточной организации, у
которых ядерный материал не отделен от цитоплазмы элементар­
ными мембранами и не связан (!?) с какими-либо основными
белками. Цитоплазма в них с нерегулярно разбросанными рибо­
сомами (70S-THna) неподвижна, клетки не обладают способностями
к эндо- и экзоцитозу. В большинстве своем бактерии одноклеточны,
наименьший диаметр их 0,2 — 10,0 мкм.
Все бактерии составляют единое царство Bacteria, хотя одни из
27
них — археобактерии (Archaeobacteria) заметно отличаются от
других, названных эубактериями (Eubacteria) (От греч. ей — хоро­
шо) . Очевидно, археобактерии являются более древними предста­
вителями прокариот, чем эубактерии. Они обитают в средах с
экстремальными условиями (от лат. extremus — крайний) — высо­
кие концентрации неорганических солей, повышенные темпера­
туры, оксид и диоксид углерода — как единственные источники
углерода. К археобактериям относятся галобактерии, термоацидо­
фильные бактерии и метанобразующие, или метаногенные бакте­
рии (рис. 1Б). Дендрограмма (от греч. dendron — дерево, gramma
— описание) прокариот может быть изображена следующим об­
разом:
Галофильные Термоапидофиль— Метаногенные Фототрофные Хемотрофные
бактерии ные бактерии бактерии бактерии бактерии

Ар х е о б а к т е р и и • Эубактерии

Предковые формы
Фототрофными бактериями являются оксигенные цианобакте-
рии, аноксигенные пурпурные и зеленые бактерии; хемотрофными
— грамположительные и грамотрицательные бактерии и бациллы,
миксобактерии, стебельковые и почкующиеся бактерии, вибрио­
ны, спириллы, спирохеты, актиномицеты, коринебактерии, мико-
бактерии, риккетсии, хламидии, микоплазмы и спироплазмы.
Галобактерии включают роды Haloarcula, Halobacterium,
Halococcus, Natrobacterium, Natrococcus. Они обнаруживаются в
морских солеварнях (оптимум натрия хлорида для них 3,5 — 5 М).
Термоацидофильные бактерии обитают в кислых горячих ис­
точниках при рН 2 — 3 и температуре 70° — 90°С (Sulfolobus
acidocoldarius), в самонагревающихся терриконах угольных шахт
при рН 1 — 2 и температуре 59°С (Thermoplasma acidophilum), в
горячих источниках на дне морей и на склонах вулканов при
температуре 85 — 105°С (Thermoproteus tenax, Т. neutrophilia и
АР-)-
Метаногенные бактерии, к которым относятся кокки
(Methanococcus vannielli), сарцины (Methanosarcinabarkeri), палоч­
ки (Methanobacteriumformicicum, Methanobrevibacterruminantium),
спириллы (Methanospirillum hungatei) и другие формы, являются
анаэробными микроорганизмами. Они обитают в отстойниках
сточных вод городов и населенных пунктов, в навозе, в осадках на
дне прудов и озер, в рисовых полях, в лиманах и эстуариях (от лат.
aestuarium — берег, заливаемый приливом), в рубце жвачных
28
животных. Приуроченность их к широкому диапазону температур
естественна, учитывая среды обитания. Тем не менее, например в
рубце жвачных животных температура достаточно постоянная. .
Согласно определителю Д. X. Берги (1984, 1986) археобактерии
относятся к отделу мендосикутов, все другие бактерии, или эубак-
терии — к отделам: грациликутов, фирмикутов и тенерикутов (от
лат. mendosus—ложный, фальшивый, gracilis—стройный, тонкий,
firmus — прочный, tener—чувствительный, нежный, cutis — кожа).
Грациликуты объединяют грамотрицательные бактерии с двух­
слойной клеточной стенкой (они, как правило, содержат фосфо-
липидную мембрану во внешнем слое клеточной стенки). Форма
клеток у них различная — от сферической до палочковидной, от
прямых до искривленных (изогнутых); подвижные или неподвиж­
ные; не образуют эндоспор, размножаются делением (некоторые
— почкованием); многие обладают пилями (волосками, или фимб-
риями). По типам питания к грациликутам относятся фототрофы
(включая цианобактерии) и хемотрофы, по типам дыхания —
аэробы, анаэробы и факультативные анаэробы, по патогенности
— сапрофиты и паразиты.
Микроорганизмы с многослойным муреиновым каркасом от­
носятся к фирмикутам. Все они грамположительные, спорообра-
зующие или не образующие спор; сюда же включены актиноми-
цеты и родственные им бактерии. Форма клеток различная —
круглые, палочковидные, ветвящиеся, нитевидные, неветвящиеся.
По типу питания — преимущественно хемогетеротрофы, по типу
дыхания — аэробы, анаэробы и микроаэрофилы, патогенные и
сапрофиты.
К тенерикутам относятся микоплазмы и спироплазмы (от греч.
myxes — гриб, plasma — вязкая, эластичная; speira — завиток,
спираль, кольцо) (рис. 1Б). Это мельчайшие свободноживущие
полиморфные бактерии, без клеточной стенки, сгруппированные
в классе Mollicutes (от лат. mollis — мягкий). Воспроизводятся они
почкованием, делением, сегментацией ветвистых структур; цитоп-
лазматическая мембрана трехслойна; все известные виды микоп-
лазм патогенны. Диаметр их 0,15 — 0,25 мкм, хотя полиморфизм
по длине клеток весьма широкий. Микоплазмы полностью устой­
чивы к пенициллину; растут на специальных агаризованных сре­
дах.
К мендосикутам относится единственный уже рассмотренный
класс археобактерии, заметно отличающийся от других микроор­
ганизмов.
Известны еще так называемые мини- и макси-клетки бактерий,
29
в частности, Е. coli. Установленно, что клетки кишечной палочки,
несущие две мутации (min А и min В) делятся ассиметрично и в
каждое второе деление образуется круглая безъядерная мини-клет­
ка (примерно в 3 раза меньше родительской клетки по размеру).
Мутации в генах гее А и uvr А сопровождаются инактивацией
основных систем репарации и существенным возрастанием чувст­
вительности клеток к ультрафиолетовым лучам. Клетки Е. coli при
этом увеличиваются в размерах (макси-клетки). Мини- и макси-
клетки используются для включения многокопииных плазмид при
постановке генно-инженерного эксперимента.
Бактерии подразделяют на группы по источникам энергии,
углерода и донорам электронов (таблица 2), благодаря чему можно
выделить типичных представителей в каждой из них.
Так, цианобактерии относят к первой подгруппе, зеленые
несерные бактерии — к второй, нитрифицирующие бактерии —
к третьей, водородные бактерии — к четвертой и, наконец, бациллы
и другие микроорганизмы — к пятой. Для сравнения можно
указать, что дрожжи и нитчатые грибы из эукариот также отно­
сятся к хемогетероорганотрофам.
В учебной и научной литературе можно встретить и такие
термины, как прототрофы, метатрофы, паратрофы, миксотрофы.
Следует подчеркнуть, что все эти термины были предложены в
начале XX в. в связи с разделением бактерий на группы по типам
Таблица 2. Деление микробов на группы по источникам энергии, углерода
и доноров электронов.

Источник
Номер
Группа доноров и название
энергии углерода электронов подгруппы
(водорода)
Фотот- Свет Неоргани­ Неорганические 1. Фотоавтолито-
рофные ческий вещества трофы
бактерии Органи­ Органические 2. Фотогетероор-
ческий вещества ган строфы
Хемот- Химичес­ Неоргани­ Неорганические 3. Хемоавтолито-
рофные кие ческий вещества трофы
бактерии реакции Органи­ Неорганические 4. Хемогетероли-
окисления ческий вещества тотрофы
- восста­ Органические 5. Хемогетероор-
новления вещества ганотрофы |
Примечание: + От греч. photos — свет, autos — сам, lythos — камень, trophia —
питание, etheros — иной, другой, organicos — органический.
30
питания. Так А. Фишер в 1903 г. предложил различать прототрофы
(автотрофы —'• по В. Пфеферу), не нуждающиеся в готовом орга­
ническом веществе для питания, метатрофы (гетеротрофы — по
В. Пфеферу), нуждающиеся в органическом веществе — это
большинство сапрофитных микроорганизмов, и паратрофы, пита­
ющиеся живым белком и обитающие лишь в организме других
существ — это все облигатные болезнетворные микробы; те виды,
которые могут расти на питательной среде в пробирке (in vitro) и
в организме чувствительного животного (in vivo), были названы В.
Пфефером миксотрофами (от лат. mixtus — смешанный). Приве­
денные названия (прототрофы, метатрофы и миксотрофы) теперь
имеют больше исторический смысл. В 1946 г. была предложена
классификация микробов по способам питания, или трофики,
которой пользуются и в настоящее время (таблица 3).

Т а б л и ц а 3. Деление микробов по трофике

Признак Тип питания

Источник энергии
1) живой организм Паратрофия
2) химическая реакция Хемотрофия
3) фотохимическая реакция Фототрофия
Источник углерода
1) диоксид углерода Автотрофия
2) органические вещества Гетеротрофия
Донор электрона
1) неорганический Литотрофия
2) органический Органотрофия

Применительно к характеристике способностей микроорганиз­

мов питаться живым белком in vitro или, чаще in vivo, используют
термин патогенность (от греч. pathos — болезнь, genesis — воз­
никновение, происхождение), то есть способность вызывать забо­
левание. Поэтому все бактерии по признаку патогенности подраз­
деляют на две большие группы — сапрофитные (неболезнетвор­
ные, от лат. saprotes — гниение, гниль) и патогенные (болезнетвор­
ные). Между ними находятся промежуточные виды — облигатные
и факультативные паразиты (от лат. obligatus — обязательный,
безусловный, facultativus — факультативный, возможный в изве­
стных условиях). Облигатными являются, например, спирохеты
сифилиса, гонококки, факультативными — синегнойная палочка,
вульгарный протей. Следовательно, облигатные, или безусловные
паразиты не развиваются вне организма или развиваются с трудом
на питательных средах с нативными белками; факультативные
31
паразиты растут и размножаются во внешней среде, но при
некоторых обстоятельствах (например, при снижении защитных
сил макроорганизма) они могут быть причиной инфекционного
(заразного) заболевания.
У фототрофных и хемотрофных бактерий, различающихся по
источникам потребляемой энергии, существенно различны и ре­
акции, лежащие в основе энергетического и конструктивного
обменов. В любом случае разнообразие бактериальных видов
настолько велико, что даже ничтожно малая доля их, используемых
в биотехнологических целях, требует к себе исключительного
внимания. Достаточно назвать из числа эубактерий такие далеко
отстоящие микроорганизмы, как Micromonospora sp. из группы
актиноплан, Hydrogenomonas (Alcaligenes) eutropha из группы во­
дородных бактерий, Lucibacterium harveyi из группы светящихся
бактерий, палочку туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis, не­
которых псевдомонасов (например, Pseudomonas aeruginosa), эше-
рихии (Escherichia coli) и многие другие, то становится понятной
исключительная важность бережного (можно сказать — любовно­
го) обращения с каждым биообъектом для сохранения стабильно­
сти его морфо-физиологических свойств и продуктивности в со­
ответствующих условиях.
2.3. Г р и б ы. К царству низших эукариот — Mycota относятся
микромицеты, то есть микроскопические грибы (например, дрож­
жи, пенициллы, аспергиллы и др.) и макромицеты, формирующие
в процессе своего роста и развития визуально наблюдаемые пло­
довые тела — трутовики, агариковые грибы и др. Микро- и
макромицеты могут быть объектами биотехнологии.
Примечательно, что грибы имеют сходство и с растениями
(верхушечный, или апикальный рост, прочная клеточная стенка,
наличие вакуолей и поперечных перегородок у многих из них) и
с животными (гетеротрофный тип питания, большая или меньшая
потребность в витаминах, наличие хитина или хитозана, синтез
гликогена). Следовательно, грибы эволюционно произошли рань­
ше — до дивергенции растений и животных в самостоятельные
царства. В то же время лишь грибам присуще мицелиальное
строение и, как следствие, абсорбционный способ питания (осмот-
рофия), для них известны явления дикариозиса (раздельное на­
хождение двух ядер в одной клетке, способных к одновременному
делению и имитирующих диплоидное ядро) и гетерокариозиса
(нахождение разнокачественных ядер в одной клетке).
Основные таксономические группы грибов (от греч. taxis —
32
приведение в порядок, устройство, nomos — закон) являются
достаточно устоявшимися, однако предлагаемые разными автора­
ми классификационные схемы весьма многочисленны и, порой, во
многом различны. В этой связи целесообразно и научно оправданно
придерживаться следующей схемы. Царство грибов включает два
отдела — Myxomycota и Eumycota, то есть грибы-слизевики (от
греч. туха — слизь) и настоящие грибы (от греч. ей — хорошо, в
смысле — типичный, хорошо развитый). Первые из них немного­
численны и представлены "голой" плазменной массой — плазмо­
дием. Они претерпевают своеобразный цикл развития и образуют
половые аттрактанты (от лат. attractio — притяжение, тяготение).
Отдел эумицетов включает 7 классов: Chytridiomycetes,
Hyphochytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes,
Basidiomycetes и Deuteromycetes. К хитридиевым (от греч.
chytridion — капелька, что отражает содержание капли жира в
зооспорах) относится более 500 видов грибов, в основном пред­
ставленных плазмодиальными образованиями, то есть у них пол­
ностью отсутствует мицелий, а если он есть, то находится лишь в
зачаточном состоянии. Зооспоры и планогаметы (клетки размно­
жения) располагают только одним задним бичевидным (плетевид­
ным) жгутиком, что имеет определенное таксономическое значе­
ние.
Гифохитридиевые имеют зооспоры с одним передним биче­
видным жгутиком, нити их не имеют перегородок, класс представ­
лен немногими видами.
Оомицеты также включают свыше 500 видов. Это водные
грибы, объединяемые на основании оогамии — полового процесса.
Бесполые зооспоры их обладают двумя разными жгутиками, один
из которых передний сверкающий (блестковидный, перистый),
другой — задний бичевидный.
Зигомицеты, включающие свыше 500 видов, полностью утра­
тили подвижные стадии в циклах развития. Половой процесс у них
— зигогамия. Мицелий, как правило, хорошо развит и, в основном,
без перегородок.
Нередко, в отечественной и зарубежной учебной и научной
литературе все, преимущественно водные, грибы (включая и "вы­
шедших на сушу" зигомицетов) объединяют в один класс
Phycomycetes (от греч. phycos — водоросль). Все водные грибы
либо лишены мицелия, либо он в зачаточном или развитом состо­
янии, но не имеет перегородок (септ) или они редкие — такие
грибы относят к низшим. Нитчатые грибы с перегородками в
2 т. 8524 33
мицелии относят к высшим. Не путать эти понятия с понятиями
совершенные и несовершенные грибы, из коих первые обладают
половым процессом размножения, вторые — не обладают им.
Например, Mucor rouxii является НИЗШИМ совершенным грибом, а,
например, Stilbella aurantica является высшим несовершенным
грибом.
Следовательно, к высшим грибам относят аскомицеты, или
сумчатые грибы; базидиомицеты, или базидиальные грибы и дей-
теромицеты, или несовершенные грибы (Fungi imperfecti).
Сумчатые грибы — наиболее обширный класс, включающий
свыше 15 000 видов самых различных строения, формы и место­
обитания. Отличительным признаком их являются сумки, образу­
ющиеся на аскогенных гифах в результате полового процесса. В
сумках формируются половые споры, с помощью которых они
размножаются. Чаще образуется 8 спор, хотя нередки и исключе­
ния из этого правила. Мицелий у них септированный (от лат. septum
— перегородка), в септах имеются центральные поры, обеспечи­
вающие сообщения между клетками и обмен клеточным содержи­
мым.
Сформировавшиеся сумки образуют плодовые тела, которые
могут быть закрытыми (клейстотеции, или клейстокарпии, от лат.
cleistos — могущий закрываться, смыкающийся; teke — капсула,
покрышка, мешок; carpos — плод), грушевидными с круглой по-
рой-остиолой наверху —перитеции (от греч. peri — вокруг) и
открытыми блюдцевидными или чашевидными апотециями (от
греч. приставки аро — со значением удаления или отделения,
обратности или возвращения и др.). Для сумчатых грибов харак­
терно и бесполое размножение с помощью конидий, образующих­
ся на гаплоидном мицелии. Следовательно, в цикле развития
аскомицетов имеются половые и бесполые стадии (рис. 2).
Базидиальные грибы. Насчитывается свыше 30 000 видов ба-
зидиомицетов (от греч. basis — основание), различающихся боль­
шим разнообразием по строению, форме и размерам.-Для базиди-
омицетов так ж е характерны половая и бесполая стадии развития.
Первая завершается формированием базидии — репродуктивного
органа, на котором образуются, как правило, по 4 споры (базиди-
оспоры), сидящих на стеригмах. Бесполая стадия кратковременна
— она представлена прорастающими трубками спор и позже —
дикариотическим мицелием. Из этого последнего возникает пло­
довое тело — базидиокарп, на котором затем образуются базидии.
Для многих базидиомицетов характерны пряжки (рис. 3), об­
разующиеся на мицелии и участвующие в синхронном процессе
деления ядер, а в мицелиальных септах — долипоры (см. рис. 32).
34
 Аскоспоры
Антеридий 6
(+)

Рис. 2. Цикл развития аскомицетов на примере Pyionema species: 1-мицелий, 2-ко-

нидии, образующиеся на гиплоидном мицелии, 3-( + ) и (-) типы спаривания (соот­
ветственно мужские и женские клетки), 4-аскогенные гифы (а-д), 5-сумки со спо­
рами, 6-аскоспоры.
Дейтеромицеты (от греч.
deiteros — второй) — сбор­
ный класс грибов, поскольку
в него включены все те пред­
ставители микромицетов, у
которых не обнаружен поло­
вой процесс развития. Если
же половая стадия выявляет­
ся, то такой гриб сразу же Рис. 3. Пряжки у базидиальных грибов.
переносят в соответствую­
щий ему класс.
Насчитывают многие тысячи видов несовершенных грибов. Им
присущ хорошо развитый септированныи мицелий и конидиальное
(бесполое) спороношение. У несовершенных грибов могут иметь
место гетерокариоз и парасексуальный цикл.
Лишайники (от лат. Lichenes) — это естественные симбионты
грибов (микобионтов) и водорослей (фикобионтов) или грибов и
цианобактерий (бактериобионтов). Лишайники выделяют в само­
стоятельную группу организмов, изучаемую в специальной науч-
35
ной дисциплине—лихенология. В настоящее время известно около
30 000 видов лишайников. Микобионтами у них выступают пре­
имущественно аскомицеты (исключительно редко — базидиоми-
цеты), фикобионтами и бактериобионтами — зеленые и желто-зе­
леные водоросли, цианобактерии. Называют лишайники по мико-
бионту. Лишайники подразделяют по форме на листоватые (в том
числе — кочующие), кустистые и корковые (накипные). Размно­
жаются они бесполым (кусочками, конидиями) и половым путем
за счет микобионта (рис. 4).

Рис. 4. Лишайники: корковый или накипной - 1, листоватый - 2, кустистый - 3,

кочующий - 4.
Из сказанного можно составить представление о том, что
потенциальных биообъектов для использования в производстве
самых различных веществ обильное множество и большинство из
них лежит пока нетронутым кладом для будущих поколений кла­
доискателей.
2.4 Р а с т е н и я . Царство растений Plantae включает подцарства
багрянок (Rhodophyta), водорослей (Phycophyta) и высших расте­
ний (Embryophyta). У первых двух нет дифференциации тела на
органы и ткани — они представляются слоевищем (thallus) и
обитают главным образом в воде. Тело высших растений расчле­
нено на органы и ткани. К настоящему времени насчи­
тывают сотни тысяч видов растений, многие из которых исполь­
зуют в различных отраслях народного хозяйства.
Для растений характерны: способность к фотосинтезу, наличие
целлюлозы, биосинтез крахмала.
2.4.1. В о д о р о с л и . К водорослям относятся: багрянки,
пиррофитовые, золотистые, желто-зеленые, эвгленовые и харовые.
36
Как правило, водоросли являются водными организмами, их на­
считывают около 100 000 видов. Все они пигментированы за счет
хлорофилла, каротиноидов, ксантофиллов, фикобилинов. Водорос­
ли — важный источник различных полисахаридов и других био­
логически активных веществ. Размножаются они вегетативно,
бесполым и половым путями. Как биообъекты используются недо­
статочно, хотя, например, ламинария под названием морской
капусты производится промышленностью различных стран. Хоро­
шо известны агар-агар и альгинаты, получаемые из водорослей.
2.4.2. К л е т к и в ы с ш и х р а с т е н и й . Высшие растения
(порядка 300 000 видов) — это дифференцированные многоклеточ­
ные, преимущественно наземные организмы. Способы их беспо­
лого и полового размножения хорошо описаны в учебниках бота­
ники. В процессе дифференциации и специализации клетки рас­
тений группировались в ткани (простые — из однотипных клеток,
и сложные — из разных типов клеток). Ткани, в зависимости от
функции, подразделяют на образовательные, или меристемные (от
греч. meristos — делимый), покровные, проводящие, механические,
основные, секреторные (выделительные). Из всех тканей лишь
меристематические способны к делению и за их счет образуются
все другие ткани. Это важно для получения клеток, которые затем
должны быть включены в биотехнологический процесс (см. спе­
циальную часть),
Клетки меристемы, задерживающиеся на эм­
бриональной стадии развития в течение всей
жизни растения, называются инициальными,
другие постепенно дифференцируются и превра­
щаются в клетки различных постоянных тканей
— конечные клетки.
В зависимости от топологии в растении мери­
стемы подразделяют на верхушечные, или апи­
кальные (отлат. apex — верхушка), боковые, или
латеральные (от лат. lateralis — боковой) и про­
межуточные, или интеркалярные (от лат.
intercalaris — промежуточный, вставной) (рис. 5).
В 1902 г. Г. Хаберландт впервые сделал попыт­
ки культивировать клетки растений. В середине Рис. 5. Меристемы
растительные: вер­
текущего столетия промышленное производство хушечные — 1,бо­
декоративных и плодоовощных культур в ряде ковые — 2, проме­
стран мира базировалось преимущественно на жуточные — 3.
37
методе культур тканей и органов растений — были получены линии
с заданными характеристиками. Здесь следует отметить, что Г.
Хаберландт впервые выдвинул гипотезу о тотипотент-
н о с т и любой живой клетки растения. Тотипотентность — это
свойство соматических клеток растений полностью реализовать
свой потенциал развития вплоть до образования целого растения.
Любой вид растения может дать в соответствующих условиях
неорганизованную массу делящихся клеток — каллус (от лат. callus
— мозоль), особенно при индуцирующем влиянии растительных
гормонов. Массовое производство каллусов с дальнейшей регене­
рацией побегов пригодно для крупномасштабного производства
растений. Вообще каллус представляет собой основной тип куль­
тивируемой на питательной среде растительной клетки. Каллусная
ткань из любого растения может длительно рекультивироваться.
При этом первоначальные растения (в том числе и меристемати-
ческие), дедифференцируются и деспециализируются, но индуци­
руются к делению, формируя первичный каллус.
Кроме выращивания каллусов удается культивировать клетки
некоторых растений в суспензионных культурах.
Важными биообъектами представляются также и протопласты
растительных клеток. Методы их получения принципиально сход­
ны с методами получения бактериальных и грибных протопластов.
Последующие клеточно-инженерные эксперименты с ними заман­
чивы по возможным ценным результатам.
2.5. К л е т к и ж и в о т н ы х . Из царства Ariimalia биообъектами
могут быть простейшие организмы — Protozoa и высшие животные.
И если сегодня о биотехнологии Protozoa мало что-либо известно,
то применительно к биотехнологии животных имеются внедрен­
ные развитые технологические процессы, написаны соответству­
ющие монографии в нашей стране и за рубежом. Тем не менее,
высокие дифференциация и специализация эукариотических кле­
ток животНых объясняют те трудности, с которыми приходится
сталкиваться исследователям и практическим работникам, имея
дело с подобным материалом.
Простейшие (Protozoa) — это одноклеточные микроскопиче­
ские животные. В данном отделе различают классы жгутиковых
(Flagellata, или Mastigofora, от лат. flagellum — бич, жгут, masticatus
— жевательный, от греч. foros — нести), саркодовые (Sarcodina, от
греч. sarcos — мясо), споровики (Sporozoa) и реснитчатые (Ciliofora,
38
или Ciliata). Простейшие широко распространены в природе,
некоторые из них обитают и в теле человека. По своему строению
клетки их напоминают клетки животных и содержат все основные
структурные элементы (органоиды и включения). Многие протозоа
активно передвигаются с помощью ложноножек, жгутиков и ре­
сничек. По типу питания они являются гетеротрофами, обладаю­
щими специальными структурами для захвата пищи или поглощают
ее посредством фагоцитоза.
Культивирование протозоа in vitro не простое, однако доступно
при необходимом усердии, а препарат "круцин" из Trypanosoma
kruzi является свидетельством удачного использования этого орга­
низма в биотехнологии.
В начале XX в. Р. Гаррисон и А. Каррель установили факт
возможного культивирования клеток животных in vitro, то есть они
доказали способность животных клеток к независимой жизни в
питательной среде вне живого организма.
С учетом всех особенностей животных клеток (в отличие,
например, от растительных и бактериальных) порой невозможно
отказаться от них во избежание каких-то чрезвычайных затрудне­
ний, так как лишь только с их помощью можно получить какой-то
особый продукт (вещество). Для примера назовем моноклональные
антитела, получение трансгенных животных и т. д.
Для реализации биотехнологических процессов важными па­
раметрами биообъектов являются: чистота, скорость размноже­
ния клеток и репродукции вирусных частиц, активность и ста­
бильность биомолекул или биосистем.
Следует иметь в виду, что при создании благоприятных условий
для избранного биообъекта биотехнологии эти ж е условия-могут
оказаться благоприятными, например, и для микробов — контами-
нантов, или загрязнителей (от лат. contaminatio — заражение,
загрязнение). Представителями контаминирующей микрофлоры
оказываются вирусы, бактерии и грибы, находящиеся в культурах
растительных или животных клеток. В этих случаях микробы-кон-
таминанты выступают вредителями производств в биотехнологии.
При использовании ферментов в качестве биокатализаторов воз­
никает необходимость предохранения их в изолированном или
иммобилизованном состоянии от деструкции банальной сапрофит­
ной (не болезнетворной) микрофлорой, которая может проникнуть
в сферу биотехнологического процесса извне вследствие несте-
39
рильности системы, например, из-за негерметичности в каком-ли­
бо узле.
Скорости размножения клеток и репродукции вирусных час­
тиц прямо пропорционально сказываются на возрастании клеточ­
ной массы и образовании метаболитов или, применительно к
фагам, на возрастании массы лизирующихся клеток. В этом смысле
подавляющее большинство микроорганизмов выгодно отличается
от клеток растений и животных. Однако не следует упускать из
виду важность конечного продукта. Например, уже упомянутые
моноклональные антитела можно получить лишь с помощью жи­
вотных клеток, когда длительность культивирования их не приоб­
ретает самодовлеющего значения.
Активность и стабильность в активном состоянии биообъектов
— одни из важнейших показателей их пригодности для длительного
использования в биотехнологии.
Таким образом, независимо от систематического положения
биообъекта, на практике используют либо природные организо­
ванные частицы (фаги, вирусы) и клетки с естественной генети­
ческой информацией, либо клетки с искусственно заданной гене­
тической информацией, то есть в любом случае используют клетки,
будь то микроорганизм, растение, животное или человек. Для
примера можно назвать процесс получения вируса полиомиелита
на культуре клеток почек обезьян в целях создания вакцины против

Рис. 6. Биореактор фир­

мы Inceltech для выращи- p„ C - 7 Биореактор для
вания бактерий и грибов растений (общий вид),
(общий вид).
40
этого опасного заболевания. Хотя мы заинтересованы здесь в
накоплении вируса, репродукция его протекает в клетках живо­
тного организма. Другой пример с ферментами, которые будут
использованы в иммобилизованном состоянии. Источником фер­
ментов также являются изолированные клетки или специализиро­
ванные ассоциации их в виде тканей, из которых изолируют
нужные биокатализаторы.
Биотехнологии присущи свои специфические методы — это
крупномасштабное глубинное культивирование биообъектов в пе­
риодическом, полунепрерывном или непрерывном режиме; выра­
щивание клеток растительных и животных тканей в особых усло­
виях. Биотехнологические методы культивирования биообъектов
выполняются в специальном оборудовании, например, в фермен­
таторах выращивают бактерии и грибы при получении антибио­
тиков, ферментов, органических кислот, некоторых витаминов
(рис. 6);
в подобных же ферментаторах выращивают некоторые клетки
человека (бласты) для получения белка — интерферона. Раститель­
ные клетки чаще выращивают в стационарных условиях на среде
с уплотненной (например, агаризованной) подложкой в стеклян­
ных или полиэтиленовых емкостях, хотя некоторые виды расти­
тельных клеток можно культивировать в специальных фермента­
торах (рис. 7). .
В стеклянных роллерах культивируют и большинство живо­
тных клеток или, например, в куриных эмбрионах.
Другие методы, используемые в биотехнологии, являются об­
щими, например, с методами в микробиологии, биохимии, биоин­
женерии, органической химии и других науках.
Тем не менее, следует особо выделить методы клеточной и
генной инженерии, когда в экспериментальных условиях удается
создавать клетки с заведомо известными свойствами. Так осуще­
ствлены соматическая гибридизация клеток картофеля и томата
(гибрид назван "помато"), перенос генетической информации о
синтезе человеческого или животного гормона инсулина в бакте­
риальные клетки (кишечной палочки), способных затем продуци­
ровать полипептидные цепи инсулина.
Эти методы и, прежде всего, генно-инженерные легли в основу
современной биотехнологии. Более того, некоторые ученые стре­
мятся отождествить генную инженерию и биотехнологию, а это
41
неправильно, поскольку генная инженерия представляет методи­
ческую сущность биотехнологии. Наука не может быть наукой,
если в ее определении отсутствуют специфичные, только ей при­
сущие, объекты и методы.
Однако даже в случае реализации генно-инженерных разрабо­
ток измененная наследственная информация на уровне молекул
инкорпорируется затем в клетках, с которыми и приходится иметь
дело в биотехнологическом процессе. Из этого можно вывести
представление об уровнях биотехнологии: клеточном и молеку­
лярном. Тот и другой определяются биообъектами. В первом случае
дело имеют с клетками, например, актиномицетов при получении
антибиотиков, микромицетов при получении лимонной кислоты,
животных при изготовлении вирусных вакцин, человека при из­
готовлении интерферона. Во втором случае дело имеют с молеку­
лами, например, с нуклеиновыми кислотами в так называемой"ре-
комбинантной ДНК-биотехнологии" (рДНК-биотехнология), бази­
рующейся на генной инженерии и составляющей сущность пред­
мета "Молекулярная биотехнология"; или на использовании отдель­
ных ферментов (ферментных систем), например, протеаз в мою­
щих средствах, липаз для модификации вкуса молочных продуктов
и т. д. Однако необходимо помнить, что в начальной или конечной
стадии молекулярный уровень трансформируется в клеточный.
Так, ферменты продуцируются клетками, а при генно-инженерных
разработках реципиентом новой генетической информации стано­
вится также клетка.
Особенность методов, используемых в биотехнологии, заклю­
чается в том, что они должны выполняться, как правило, в асеп­
тических условиях (от греч. а — не, septicos — гнилостный), то
есть при исключении возможности попадания в среду культиви­
рования биообъекта болезнетворных (патогенных) и неболезнет­
ворных (сапрофитных) микроорганизмов. Патогенные виды пред­
ставляют непосредственную опасность для занятых в производстве
людей и для потребителей конечных продуктов; сапрофитные виды
могут выступать конкурентами за питательные субстраты, антаго­
нистами, продуцентами токсических веществ, включая пирогены.
42
 Часть II.
Роль фундаментальных исследований
в развитии биотехнологии
Подразделение научных исследований (равно как и наук) на
фундаментальные и прикладные в какой-то мере условно, хотя
фактически эти термины в достаточно широком ходу. Более того,
фундаментальные и прикладные исследования включают в перс­
пективные планы научных разработок в соответствующих акаде­
мических и отраслевых учреждениях.
Принято считать, что фундаментальные (от лат. fundamentum-
основа, опора, основание) исследования изначально нацелены на
решение основополагающих проблем, а конкретные результаты,
вытекающие из них, составляют суть прикладных исследований.
Это можно показать на следующих примерах (таблица 4).
43
Т а б л и ц а 4. Соотношение фундаментальных и прикладных исследований
Научные исследования
| фундаментальные
| Открытие Г. Менделем единиц
I наследственности у садового гороха;
I исследования Т. Моргана и
I сотрудников с мушкой дрозофилой,
1 приведшие к всеобщему признанию
| законов Менделя.
| Вскрытие Л. Пастером причины
1 болезни шелковичных червей во
I Франции.
I Обезвреживание болезнетворных
I микробов при сохранении их
| антигенности.
I Выведение М. Фарадеем законов
I электролиза на основании изучения
1 действия электрического тока на
I водные растворы различных веществ.
| Открытие радиоактивных элементов
I Марией и Пьером Кюри.
I Формулирование проблемы
| антагонизма между микробами и ее
I экспериментальное подтверждение.
Подобного рода примеры весьма многочисленны и множество
их убедительно доказывает скорость и глубину социального про-
44
прикладные
На основании принципов Менделя -
Моргана были созданы
рациональные методы селекции в
растениеводстве и животноводстве, в
микробиологии. С помощью этих
методов были выведены новые сорта
сельскохозяйственных растений,
новые породы домашних животных,
высокопродуктивные штаммы
микроорганизмов; выявлены
наследственные болезни у человека,
определены пути и созданы методы
рациональной их профилактики и
терапии.
Разработаны и осуществлены меры
по спасению производства шелка.
Создание профилактических и
лечебных иммунопрепаратов
(вакцин, сывороток,
иммуноглобулинов).
Создание методов и приборов для
выделения веществ при электролизе,
для определения
электропроводности, для
профилактической и
терапевтической электростимуляции
при некоторых патологических
состояниях у людей и т. д.
Создание и применение
рентгеновских методов
исследования, радиотерапия раковых
заболеваний, эксплуатация атомных
электростанций и др.
Создание промышленности
антибиотиков и применение
антибиотических препаратов в
здравоохранении.
гресса человечества на долгом пути его эволюции. И наука здесь
выступает решающим фактором, так' как наука - это отрасль
человеческой деятельности, направленная на познание мира (ми­
роздания).
Фундаментальные исследования завершаются, как правило,
установлением или доказательством новых фактов, закономерно­
стей в соответствующей отрасли знаний. Рано или поздно эти
факты (закономерности) находят практическое воплощение. Тем
не менее, нельзя противопоставлять фундаментальные и приклад­
ные исследования, так как на определенном этапе нередко можно
видеть трансформацию их в противоположном направлении. На­
пример, на основании обобщения полученных сведений о нукле­
иновых кислотах Дж. Уотсон и Ф. Крик смогли предложить
природную модель двойной спирали ДНК и, тем самым, подвели
материальный фундамент под ранее известный якобы "мифиче­
ский" ген. На этой основе возникли многочисленные практические
разработки по молекулярной биологии гена и, в том числе, напри­
мер, по мутагенезу. С другой стороны, практические разработки
по выделению и манипулированию с ДНК различного происхож­
дения стали основой для постулирования общегенетических зако­
нов, присущих всему живому. Вот почему и сегодня справедливы
слова великого Л. Пастера, сказанные по этому поводу: "Нет,
тысячу раз нет, не существует ни одной категории наук, которой
можно было бы дать название прикладых наук. Существуют науки
и приложение наук, связанные между собой как плод и породившее
его дерево".
Биологическая технология - как наука является воплощением
симбиоза теоретических исследований и практической реализации
предварительно полученных фактов в работах с организованными
частицами (вирусами), клетками и тканями, с первичными и вто­
ричными метаболитами, с генетическим материалом.

Глава 3
Фундаментальные исследования
в области энзимологии
Любая клетка - целостная система, составные части которой
структурно и функционально взаимозависимы. Эта зависимость
выражается прежде всего в генетически обусловленном синтезе
белковых молекул - преимущественно ферментов. В хронологиче­
ском порядке только белки - продукты матричного синтеза должны
45
относиться к разряду первичных; все другие молекулы, возника­
ющие под каталитическим .действием ферментов, оказываются
вторичными. Выдающийся шведский химик И. Я. Берцелиус,
предложивший в 1836 г. термин "катализ" (за 35 лет до выявления
М. Манасеиной каталитических функций дрожжевого сока в 1871
г.), пророчески писал: "У нас есть все основания предполагать, что
в тканях и жидкостях растений и животных происходят тысячи
каталитических процессов". И это в то время, когда ферменты еще
не были известны науке. Теперь, например, утверждается, что в
мельчайшей клетке (0,1 мкм в диаметре), относящейся к Mollicutes,
содержится более, чем 100 ферментов, то есть столько, чтобы
клетка могла самостоятельно функционировать как организм. Ес­
тественно, что в клетке других прокариот и эукариот насчитывают
более 1000 биокатализаторов. Большинство микробов лишено спе­
циализированных структур, хотя бы отдаленно напоминающих
органы дыхания, пищеварения и другие, присущих высшим эука-
риотам. Поэтому основная метаболическая нагрузка (метаболизм
- это биологический обмен веществ и энергии) в процессах их
роста, развития и размножения падает на ферменты. В любой
живой клетке находятся малые и большие (полимерные) молекулы
различных веществ. Они должны синтезироваться в клетке, а
некоторые секретироваться из нее (нередко, распадаясь перед этим
на более мелкие составные части или их производные). Во всех
таких процессах участвуют ферменты. Уже сегодня известно около
2000 индивидуальных ферментов и это не предел. В клетках
прокариот и эукариот ферменты распределены и локализованы
целесообразно, например, в цитоплазме находятся почти все фер­
менты гликолиза, в матриксе митохондрий - ферменты цикла
трикарбоновых кислот и |3-окисления жирных кислот, ферменты
окислительного фосфорилирования - во внутренней мембране
митохондрий.
В клетке E.coli нить ДНК имеет размеры 1,4»106хЗ,0 нм, а массу
1»10"14 г. В разомкнутом состоянии длина ее составит примерно 1,4
мм, то есть подобная ДНК приблизительно в 500 раз длиннее
бактериальной клетки, вмещающей эту ДНК. Такая хромосома
кишечной палочки заключает в себя- информацию, достаточную
для кодирования 4500 белков, значительная часть которых будет
представлена ферментами.
Ферменты составляют основную массу клеточных белков. На
долю одного фермента приходится от сотых долей процента (у
некоторых вирусов) до 10-12% (у ряда микроорганизмов клеточной
организации, например у E.coli). В то ж е время хромосомная ДНК
не есть простая последовательность множества генов. Поэтому
46
нельзя считать, что количество хромосомной ДНК, например у
представителей эукариотических организмов пропорционально
уровню их эволюционного развития. В таком случае некоторые
лягушки и рыбы были бы развиты более, чем животные и человек,
поскольку у них размер генома достигает 1010 - 1 0 " пар нуклеотидов
(пн), а у млекопитающих и человека он на 1 - 2 порядка н и ж е (109
- 1010 пн). Суть здесь в том, что у высокоразвитых существ
значительная часть ДНК оказываетсяя молчащей, так как она
образована не генными последовательностями (у человека к этому
типу относится 80 - 90% всей ДНК) или повторяющимися огромное
число раз идентичными последовательностями. Все это не может
не сказываться на ферментном наборе в клетках, органах и тканях,
равно как и на их функциональной активности.
Ферменты давно являются объектами биотехнологии - их ин­
дустрия зародилась в начале XX в., и объемы ферментного произ­
водства продолжают нарастать, а что касается публикаций о био­
катализаторах, то в мире появляется более 10 000 статей ежегодно.
Ферменты присущи любой живой клетке и, в небольшом ассорти­
менте - организованным частицам (вирусами). Наука, изучающая
ферменты, называется энзимологией, а инженерная энзимология
- это ветвь или субдисциплина биологической технологии, изуча­
ющая биотехнологические процессы, в которых используется ка­
талитическое действие ферментов. Главная задача инженерной
энзимологии заключается в практической реализации фермента­
тивных процессов в целях экономичного получения различных
веществ и энергии для нужд народного хозяйства.
Чтобы выйти на уровень инженерной энзимологии, необходи­
мо решать многие основополагающие проблемы и задачи, к кото­
рым можно отнести:
1) способы выделения и очистки ферментов в зависимости от
их топологии в биообъекте или при выделении в среду обитания;
2) определение состава и строения фермента;
3) особенности кинетики ферментативного действия в зависи­
мости от внешних условий;
4) оценку активности ферментов в зависимости от их чистоты
или, напротив, от наличия естественных примесей или искусствен­
ных добавок;
5) механизмы и пути регуляции синтеза и активности фермен­
тов;
6) моделирование действия ферментов в иммобилизованном
состоянии, учитывая при этом иммобилизацию индивидуальных
ферментов и полиферментных систем, каковыми являются ж и в ы е
клетки;
47
 7) аппаратурное оформление ферментативных процессов;
8) экономичность ферментативных процессов, рекомендуемых
к внедрению в производство.
Некоторые из этих проблем и задач будут рассмотрены в
данном разделе, другие (6-8) - во второй части учебника.
Распределение ферментов в клеточных структурах неравноз­
начное, и независимо от того, что биосинтез их осуществляется в
элементах ядерного аппарата, часть ферментов секретируется
внеклеточно - преимущественно гидролазы. Это обусловлено не­
обходимостью расщепления полимерных веществ до такого уров­
ня, чтобы продукты гидролиза могли поступить в клетку для
конструктивного и/или энергетического обменов.
К ферментам внеклеточного типа можно отнести микробные
амилазы, липазы и пешид-гидролазы, катализирующие реакции
гидролиза соответственно крахмала, жиров и белков. Животная
протеаза (пепсин) условно также может быть причислена в разряд
внеклеточных, так как она поступает из соответствующих клеток
(главных клеток слизистой оболочки желудка) в полость желудка;
то же можно сказать и о ферментах поджелудочной железы,
поступающих в просвет двенадцатиперстной кишки.
Следует иметь в виду, что многие ферменты синтезируемые в
клетках, являются з и м о г е н а м и , или неактивными
ферментами, и для трансформации их в активные формы необхо­
дим ограниченный (специфический) посттрансляционный проте-
олиз.
В любом случае получение экзо- и эндоферментов на опреде­
ленных этапах как бы унифицируется, когда все стадии выделения
и очистки будут определяться лишь их физико-химическими ха­
рактеристиками. Так, при выделении экзофермента клетки проду­
цента становятся отходом, а культуральная жидкость или, в другом
случае, желудочный сок - целевым продуктом-сырцом. Если речь
идет о необходимости получения эндоферментов, то содержащие
их клетки и ткани измельчают (дезинтегрируют) и экстрагируют
подходящим растворителем. Полученный раствор также представ­
ляет собой полупродукт — сырец. И если речь здесь идет об одном
и том же ферменте,- но разного происхождения и топологии (экзо-
и эндо-), то, начиная с сырца, технологические схемы их выделения
будут во многом тождественными. В этом случае можно использо­
вать такие подходы, как высаливание, сепарирование в градиентах
плотности каких-либо веществ, мембранную фильтрацию,- гель-
хроматографию, афинную хроматографию, ионный обмен и дру-
48
гие. При необходимости выделют ферменты, локализованные в
каких-либо структурах клетки. Тогда, с учетом физико-химических
характеристик таких структур (размер, плотность, форма), приме­
няют дифференциальное центрифугирование после дезинтегра­
ции клеток (тканей). При этом сферические частицы различной
плотности и/или размера будут перемещаться в центрифужной
пробирке на одно и то же расстояние за разное время. Время
прохождения частицы из одного положения (п) в другое (гг) можно
определить, исходя из следующего уравнения:
. 9 л т £2
2 0)2Д2(рр-р,) Ln
П •
где t — время, т| — вязкость центрифугируемой жидкости, ш
— угловая скорость, R — радиус частицы, рр — плотность частицы,
р/ — плотность центрифугируемой жидкости, -~ — коэффициент
силы тяжести.
Форма выделяемых частиц не всегда сферическая, и тогда в
используемые методы вносят необходимые поправки, или выбира­
ют какие-либо другие способы изоляции и расчета. Ферменты —
глобулярные белки, поэтому при их разделении играют роль, в
основном, молекулярные массы (ММ) молекул, а не число субъ­
единиц (С) в них. В качестве примера можно назвать химотрипсин
(ММ = 24500 Да, С = 3), щелочную фосфатазу (ММ = 80000 Да,
С = 2), лактатдегидрогеназу (ММ = 140000 Да, С = А), триптофаназу
(ММ = 220000 Да,С = 8), и др. Более того, известны ферменты,
катализирующие одну и ту же реакцию в организме одного вида,
но представляющие собой различные молекулярные формы. Их
называют изоферментами, выделение которых по высказанным
причинам заметно осложняется.
Большие по размеру компоненты (интактные клетки, неразру-^
шенные частицы ткани, ядра) осаждаются при дифференциальном
центрифугировании быстрее — их собирают в осадок при срав­
нительно невысоких скоростях; супернатант (от. лат. supernatans
— всплывающий), или надосадок подвергают последующему цен­
трифугированию при более высоких скоростях. При этом в осадке
могут быть митохондрии. В случае дальнейшего центрифугирова­
ния при еще более высоких скоростях вращения ротора центри­
фуги можно собрать рибосомы.
Во время вращения ротора с большой угловой скоростью со
развивается центробежное ускорение (G), во много раз превосхо­
дящее силу тяжести и способное достигать величин 600—600000 g
49
(g = ускорение силы тяжести). G = со2г (г — расстояние, пройден­
ное частицей). Так, для выделения ядер из дезинтеграта эукарио-
тических клеток требуется 10 минут центрифугирования при 600
д, для изоляции лизосом и митохондрий — 5 мин. при 15000 д, для
выделения рибосом — 1 час при 100000 д. Скорость продвижения
частицы в направлении г (Vr) описывается уравнением
Vr = -т- (t — время)
Центрифугирование дезинтеграта клеток или тканей при боль­
ших скоростях в водной суспензии представляет собой турбулен­
тный поток и сила сопротивления движению различных частиц
("твердых тел") определяется не вязкостью жидкости (т|), а ее
плотностью (р), тогда сила сопротивления называется гидравличе­
ской и описывается формулой F = C/Spv2, где F — гидравлическая
сила сопротивления, Cf — коэффициент, зависимый от формы
твердого тела, S — площадь поперечного сечения тела. Для сфери­
ческого тела значения Cf находятся в интервале 0,05 — 0,2 в
зависимости от характера поверхности (гладкая, шероховатая); для
тонкого диска, перпендикулярного потоку, Cf равна примерно 0,55.
Относительная роль динамического сопротивления и вязкого
трения сказывается на поведении движущейся жидкости и харак­
теризуется безразмерным числом Рейнольдса:

T|iv Т|
где 1 — характерный линейный размер. При обтекании тел 1 —
это длина или поперечный размер, при течении в длинных трубках
1 — это диаметр трубки. В условиях центрифугирования скорости
частиц и, следовательно, их числа Рейнольдса очень малы. Поэтому
для определения силы сопротивления среды, действующей на
частицу, пользуются законом Стокса. Согласно этому закону сила
сопротивления, испытываемая твердым шаром при его медленном
поступательном движении в неограниченно вязкой жидкости,
описывается выражением F = 67rnRv, где R — радиус шара, т|
—коэффициент вязкости жидкости, v — скорость движения шара.
Параметры движения частицы можно вычислить по следующе­
му уравнению, исключив из него коэффициент силы тяжести,
поскольку направление г перпендикулярно направлению силы
тяжести:
6m\RVr=^j- G(pp-p/),
где V r скорость частицы в направлении г, G — центробежное
ускорение, рр — плотность частицы, р/ -— плотность жидкости, Т|
— вязкость жидкости, R — радиус частицы.
50
 При подходе к выбору биообъекта—продуцента того или иного
энзима важно иметь хорошую (по скорости роста, продуктивности
и активности фермента) культуру — штамм (не клон), так как
поддерживать его в лабораторных и производственных условиях
легче, чем клон. К тому ж е клоновые культуры используют, как
правило, для генетических целей.
Необходимо иметь в виду и такие факты, как полифермент-
ность культуральных жидкостей или тканевых экстрактов, и з
которых предстоит выделить те или иные ферменты в индивиду­
альном виде. Это особенно относится к гликансинтетазам и глика-
назам, что является своеобразным отражением разветвленности
углеводных полимеров (участие в синтезе более, чем одной синте-
тазы) и их полидисперсности (опосредованность действия генети­
ческого кода на процесс синтеза полисахарида во время роста и
развития культуры клеток или ткани, то есть здесь имеет место
нематричный синтез углеводного полимера). В таких случаях це­
лесообразно применить афинную хроматографию (от англ. affinity
— сродство).
Афинная хроматография основана на специфичности биомо­
лекул. Принципиально этим методом возможно получение абсо­
лютно чистых веществ. В нативном состоянии ферменты за счет
своего активного центра и регуляторного участка (одного или
более) взаимодействуют с небольшим числом лигандов, которые
представляют собой субстраты, либо эффекторы. Благодаря высо­
кому сродству активного участка фермента к лиганду, их обрати­
мому связыванию и отсутствию какой-либо другой реакции между
лигандом и матрицей возможно эффективное проведение афинной
хроматографии.
В качестве лиганда обычно используют конкурентный обрати­
мый ингибитор (см.), его ковалентно сшивают с соответствующей
нерастворимой матрицей так, чтобы он не терял своей способности
связываться с ферментом. Матрицей с лигандом в соответствую­
щем буферном растворе заполняют колонку, а затем через нее
пропускают раствор фермента, подлежащий очистке. В колонке
задерживается лишь специфический фермент, а все другие при­
меси уходят. После этого проводят элюцию специфического фер­
мента, используя раствор субстрата в среде с другим рН и (или)
ионной силой. При разделении ферментов методом афинной хро­
матографии необходимо знать все кинетические параметры целе­
вого фермента, располагать хорошей матрицей и удачно подобран­
ным лигандом. В качестве примера приводим схему путей сшива­
ния лиганда с одной из возможных гидроксильных групп полиса-
51
харида агарозы (или сефарозы) через удлиняющие мостики, на­
пример диаминов типа H2N(CH2)XNH2 (х = 2 — 6) и е-аминокапро-
новой кислоты:
н,с—сн—сн,—сн,
3 | 2 2

£• - а м и н о к а п р о н о в а я кислота

агарозная матрица

1 "I— -|— -|—

ОН он он он

,CNBryR(CH2).NH2 ч, CN Br/NHj(CH 2 ) x NH 2
^*" бромциан

янтарный а н г и д р и д / С О (NH2^2

О
I
C=NH
I
(сн 2 ) х
R

производные
изомочееины

R - ЛИГАНД

Хорошей матрицей для афинной хроматографии является три-

сакрил марки GF 2000 (Франция), получаемый сополимеризациеи
Ы-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола и гидро-
ксилированного акрилового бифункционального мономера. Три-
52
сакрил — высоко гидрофильный сополимер за счет вторичных
амидных и первичных гидроксиметильных групп. Последние на­
ходятся на поверхности молекулы, тогда как полиэтиленовый кор
(от англ. core — сердцевина) полностью скрыт внутри.
сн,он сн2он
I I
HN—С—СН 2 ОН НМ—с—СН 2 ОН
с0
со сн,он сн2он
2
I I
—сн—сно—сн—сн,—си — сн 9 —сн —сн 5 —
2 | 2 2 , 2
СО СО
j сн2он J сн2он
HN—С—СНоОН HN—С—СНоОН
2 2
I i
сн2он сн2он
трисакрип GF2000

о 5?
0 Н-н H-0-C-R
"\N-3-23X
гн.лн Б Э / ' ^ ГА \ Aar JT^-NH-CO-R

^-O-NH-c-CHjOH » l-c-NHCC^-NHj
I
CHjOH

трисакркп GF2000 амииопроизаодное

трисакрипа GF20OO

Рис. 8. Получение некоторых сорбентов для афинной хроматографии на основе

трисакрила GF 2000 (КДА — карбонилдиимидазол, НФХФ — нитрофенилхлоро-
формиат, БЭ •— бисэпоксироны, ГА — глутаральдегид, N-3-23X — N-этоксикарбо-
нил -2-ЭТОКСИ-1, 2-дигидрохинолин, АЯК — ангидрид янтарной кислоты).
Трисакрил стабилен при разных температурах — до 121°С и
при рН1— 11, равно как устойчив к диссоциирующим агентам и
поверхностно-активным веществам. В целях использования его для
53
афинной хроматографии проводят активацию такими веществами,
как глутаральдегид, эпихлоргидрин, дивинилсульфон, р-нитрофе-
нил-хлороформиат, карбонилдиимидазол, этилендиаминидр. (рис.
8).
Активированный трисакрил используют затем для сшивания с
лигандом. В качестве примера можно привести иммобилизацию
лиганда на трисакриле, активированном глутаральдегидом (рис. 9).
О
и
сно сно
I I
^-C-NH-CH-CH-fCH^-CH^HCH^-CHO +• H2N- ЛИГАНД
(сн
I 2'3
СНО

о сно сно
II I I
-C-NH-CH-CH-JCHJ^-CH-CH-ICHJ^-CHO
(сн 2)3 NH
I , I ,
ЛИГАНД
сно
Рис. 9. Схема иммобилизации лиганда с трисакрилом, активированным глутараль­
дегидом.
В любом случае выделение и очистка ферментов — это наука,
граничащая с искусством. В самом деле, если химическая реакция
протекает с выходом 0,1% и с сотней побочных продуктов, то вряд
ли химик-органик проявит интерес к процессу получения (и, тем
более, очистки) целевого продукта. Но именно такие задачи встают
перед биотехнологами, желающими получить индивидуальный бе­
лок. В работе с биологическим материалом необходимы и важны
знания предварительных характеристик по содержанию белка в
различных биообъектах (даже в органах и тканях одного и того же
вида животного). От этого зависит выбор материала, его предва­
рительная подготовка для включения в технологический процесс.
Молекулы ферментов чувствительны к различным воздействи­
ям, поэтому при их выделении и очистке требуется соблюдать
необходимые меры предосторожности: контролировать темпера­
туру (нередко поддерживать ее близкой к точке замерзания ис­
пользуемого растворителя), рН (как правило — с помощью буфер-
54
ных растворов), концентрацию белка, ионную силу раствора,
концентрацию ионов тяжелых металлов (удаляют их с помощью
комплексообразователей, например ЭДТА), значение окислитель­
но-восстановительного потенциала (Ео), который должен поддер­
живаться на низком уровне (например, с помощью меркаптоэта-
нола). Следует иметь в виду и тот факт, что многие белки в
разбавленных растворах проявляют склонность к денатурации —
устойчивость возрастает в присутствии их субстратов.
Из вспомогательных приемов очистки ферментов часто поль­
зуются диализом, лиофилизацией, пропусканием растворов через
соответствующие молекулярные сита (гелевые, мембранные). В
качестве примера очистки гипотетического фермента приведена
таблица 5. Из данных в таблице обращают на себя внимание
сокращение объемов раствора, содержащего целевой продукт (в
200 раз), уменьшение содержания белка в 5 раз при заметном
возрастании активности фермента в 100 раз (в расчете на 1 мг
белка).
Т а б л и ц а 5. Сравнительная характеристика методов очистки фермента "X"

Активность Сум­ Сте­

Объем Содер­ марный пень
Стадии очистки удель­
раствора, жание выход, (крат­
л белка, ная, % ность)
Ед/мл
мг/мл Ед/мг очист­
белка ки

Экстракт белков -
сырец 200 2,5 100 100 100 1

Высаливание
аммония
сульфатом 80 1,25 200 160 80 4

Хроматография на
Д ЭАЭ-целлюло зе 20 1,0 500 500 37,5 12,5

Препаративный
электрофорез 5 1,0 1500 1500 37,5 37,5

Изо электрическое
осаждение 3 0,3 2000 6700 30 167

Кристаллизация 1 0,5 5000 10000 25 250

55
 Суммарный выход достаточно высокий, а степень очистки
превосходная - в 250 раз. Но такие показатели далеко не типичны
для разных ферментов.
В качестве критериев чистоты ферментов используют данные
электрофореза, ультрацентрифугирования (седиментограмма), оп­
ределения молекулярной массы различными методами, по раство­
римости (кривые растворения), оценки полидисперсности с опре­
делением специфической активности каждой фракции, хроматог-
рафирования на различных носителях и в нескольких системах,
аминокислотного состава (особенно — при обнаружении белковых
примесей), включая секвенирование (от англ. sequence — после­
довательность) на автоматизированных приборах - секвенаторах,
и т. д.
В последние годы продолжает расти интерес к внеклеточным
ферментам микроорганизмов, поскольку микробы — продуценты
относительно легко культивируются в. контролируемых условиях
и подвергаются направленному изменению в сторону получения
высокопродуктивных вариантов.
У грамположитёльных бактерий экзоферменты топологически
могут быть строго внеклеточными (многие протеазы, гликозидазы
и др.) и локализованными с наружной стороны клеточной мемб­
раны, например, ос-глюкозидаза у Вас. licheniformis (это можно
доказать при протопластировании клеток, когда ферменты пере­
ходят в окружающую среду после удаления клеточной стенки).
Грибы в отношении секреции экзоферментов уподобляют грам-
положительным бактериям. У грамотрицательных бактерий экзо­
ферменты дополнительно могут находиться в периплазматическом
пространстве. Казалось бы, что такие ферменты должны рассмат­
риваться внутриклеточными, однако они достаточно легко осво­
бождаются при осмотическом шоке или в результате протоп-
ластирования клеток.
Строго внеклеточных ферментов у грамположитёльных бакте­
рий больше, чем у грамотрицательных, однако среди последних
имеются выраженные продуценты их (аэромонасы, псевдомонасы,
некоторые энтеробактерии и др.).
Каким же образом секретируемые белки транспортируются
через структуры клеточной оболочки?
В конце 70-х годов XX в. была предложена так называемая
сигнальная гипотеза (Г. Блобели др., 1979). Согласно этой гипотезе
56
секретируемый белок через ЫН2-конец удлиняется на 15—30
аминокислот, вкупе составляющих л и д е р н ы й , или с и г н а ­
л ь н ы й пептид, направляющий рибосому, из которой он
появляется, к мембране. В мембране лидерный пептид вместе с
другими мембранными белками формирует канал, стабилизирую­
щийся при присоединении рибосомы. Рибосома синтезирует бе­
лок, и он тут же экспортируется через пору. Этот механизм
называется котрансляционной секрецией. После частичного или
полного экспорта белка сигнальный пептид удаляется с помощью
специфической сигнальной эндопептидазы. Решающую роль в
секреции играет гидрофобная центральная часть сигнальной по­
следовательности размером около 5,5 нм (от 15 до 19 аминокислот)
и находящаяся в высокоупорядоченной конформации. 1ЧН2-Конец
в составе гидрофильного домена (от англ. domain — регион,
область) присоединяется к отрицательно заряженной внутренней
поверхности цитоплазматической мембраны. В ходе трансляции
белка гидрофобный участок сигнальной последовательности по­
степенно внедряется в мембрану до появления участка расщепле­
ния в форме петли на ее внешней стороне. После этого сигнальная
эндопептидаза отщепляет сигнальную последовательность от рас­
тущей цепи полипептида, способствуя тем самым котрансляцион­
ной секреции белка (рис. 10).
К настоящему времени доказано, что котрансляционная секре­
ция присуща прокариотам и эукариотам. Таким путем секретиру-
ются, например, а-амилаза у Bac.subtilis, Р-лактамаза у
Bac.licheniformis, экзотоксин у Corynebacterium diphtheriae.
После завершения котрансляционного транспорта рецептор-
ные белки мембраны освобождаются и могут функционировать в
плоскости мембраны.
У прокариот и эукариот имеется также другой тип секреции
—посттрансляционный, когда через мембрану транспортируется
завершенный белок. Механизм транспорта объясняется либо с
привлечением триггерной гипотезы У. Уикнера (1979), либо ранее
рассмотренной сигнальной гипотезы (рис. 11). Согласно обеим
гипотезам роль белка - предшественника, обладающего сигнальной
последовательностью, весьма велика. В первом случае эта после­
довательность обеспечивает скручивание полипептида так, что
гидрофобные области его связываются с мембраной. Затем белок
может освобождаться из мембраны благодаря отделению сигналь-
57
 11 2 3 4 5 6 4 1 2 4 7 8 7 8 7 7 9 8110 711717
в

сд

(7Ъ
WWTOW
м
ш
Рис. 10. А - экспорт белка через мембрану путем котрансляционной секреции
(1 —рибосомы, 2 — мембрана, 3 — пора в мембране, 4 — сигнальная последо­
вательность, 5 — сигнальный пептид, 6 — рецептор сигнального пептида, 7 —
сайт действия сигнальной эндопептидазы, 8 — рецептор рибосомы); Б —
строение сигнального пептида белка lam В Escherichia coli (A — гидрофильный
сегмент, Б — гидрофобный сегмент, р-сайт расщепления; последовательность
а лнокислот: 1—метионин, 2 — изолейцин, 3 — треонин, 4 — лейцин, 5 —
аргинин, 6 — лизин, 7 — аланин, 8 — валин, 9 — глицин, 10 — серии, 11 —
глутамин, 12 — пролин); С — секреция белка через мембрану (М) по типу петли
(1 — NH2 - конец, 2 — гидрофобный участок, СП — сигнальная пептидаза).
58
нои последовательности за счет 5'^
эндопротеолиза. Во втором слу- j -Q---3-
чае сигнальная последователь­
ность полной полипептидной це­
пи вместе с рецепторными бел­
ками мембраны формирует по­
ры. Белок развертывается и про­
исходит перемещение (трансло­
кация), сопровождаемая удале­
нием сигнальной последователь­
ности.
Для эукариот доказано, что
их эндоплазматический ретику-
лум содержит для работающей Рис. 11. Схема посттрансляционного
рибосомы своеобразные "при­ транспорта белков через мембрану со­
чальные белки", к которым при­ гласно "триггерной гипотезе" по Уикне-
соединяется комплекс рибосомы ру (1979) — I и "сигнальной гипотезе" по
Блобелу и др. (1979) — И.
с частицей, узнающей сигналь­
ную последовательность. Частица включает шесть полипептидных
цепей и небольшую молекулу РНК с константой седиментации 7S.
Причаливание рибосомы с частицей индуцирует трансляцию при
последующей секреции растущего белка (рис. 12) до момента
появления сигнального пептида из рибосомы, когда происходит
блокада трансляции.
На основе рассмотренной
"сигнальной гипотезы" мож­
но сформулировать следую­ 'W
щие основные положения:
1) процесс экспорта бел­
ков эволюционно консерва­ I П
тивен (прокариотические Рис. 12. Начальные этапы векторного пере­
клетки узнают сигнальную носа белков в эукариотических клетках: I —
последовательность эукариот блокирование трансляции, II — снятие блока
трансляции после "причаливания" рибосомы
и наоборот); — 1, сигнальная последовательность — 2;
2) в мембране существует частица, узнающая сигнал — 3, "причаль­
некий механизм экспорта, ный" белок — 4, мембрана — 5, сигнальный
пептид — 6.
или аппарат секреции;
3) свободные рибосомы в
цитоплазме клетки и рибосомы, связанные с мембраной, не раз­
личаются между собой;
59
 4) у эукариот на эндоплазматическом ретикулуме имеются так
называемые причальные белки для функционирующих рибосом,
соединенных с частицами, узнающими сигнальную последователь­
ность;
5) секретируемые белки синтезируются обычно в форме более
длинного предшественника;
6) белки, как правило, секретируются котрансляционно (реже
— посттрансляционно), то есть растущий полипептид переносится
через мембрану по мере трансляции;
7) в структуре подлежащего секреции белка может существо­
вать "стоп"-последовательность, останавливающая секрецию и да­
ющая начало интегральному мембранному белку.
Следует вспомнить, что молекулярные массы (ММ) ферментов
достаточно большие и находятся в пределах примерно от 12 до
нескольких тысяч килодальтон (кДа). Ферменты с ММ более 100
кДа обычно представлены субъединицами (двумя и более).
Нелегко себе вообразить, например, что кишечная палочка,
размножающаяся в течение 20—30 минут, реализует множество
направленных и строго избирательных биокаталитических процес­
сов. Прямыми и косвенными доказательствами в опытах с фер­
ментом трансаминазой аспарагиновой кислоты установлено, что
отдельные стадии каталитической реакции протекают в простран­
стве около нескольких сотен кубических миллимикрометров (нм)
за время от десятитысячных до миллионных долей секунды.
Для того, чтобы управлять действием ферментов, необходимы
фундаментальные исследования по расшифровке молекулярных
основ ферментативного катализа. Многое уже сделано в данном
направлении, но это лишь начало, а желательно знать как можно
больше о всех группах ферментов.
Согласно классификации (КФ) ферменты подразделяются на
шесть главных классов, каждый из которых включает подклассы
и подподклассы:
I. Оксидоредуктазы (КФ1.) — катализируют окислительно:вос-
становительные реакции;
II. Трансферазы (КФ2.) — катализируют реакции переноса
функциональных групп (фосфатных, ацильных, гликозильных, аль­
дегидных и др.);
III. Гидролазы (КФЗ.) — катализируют реакции гидролиза
60
(перенос функциональных групп на молекулу воды);
IV. Лиазы (КФ4.) — катализируют реакции присоединения по
двойным связям и обратные реакции;
V. Изомеразы (КФ5.) — катализируют реакции изомеризации,
то есть перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных
форм;
VI. Лигазы (КФ6.) — катализируют реакции образования связей
С — С, С — S, С — О и С — N, сопряженных с расходованием
энергии АТФ или других нуклеозидтрифосфатов.
Подкласс и подподкласс ферментов соответственно обозначают
вторым и третьим числами; порядковый номер фермента - четвер­
тым числом в его подподклассе. Например, бетаин-гомоцистеин-
метилтрансфераза имеет кодовый номер (шифр) — КФ 2.1.1.5, то
есть согласно классификации (КФ) этот фермент относится к
трансферазам (И-й главный класс), переносящим одноуглеродные
остатки (первый подкласс) в форме метила — метилтрансферазы
(первый подподкласс), номер конкретного фермента 5 (бетаин:
L-гомоцистеин S-метилтрансфераза), катализируемая реакция
здесь следующая:
соог сн,—SH соон сн,—s—сн,
I . I *-. I Г
CH2-N + ==(CH3) 3 + CHj """"""Ч CH2-N = (CH3) + 0 ¾

. НС—NH, CH-NKj
6етаин
I диметипгпицин I
соон соон
L-гомоцистеин L- метионим

Классификация и номенклатура ферментов имеют универсаль­

ное значение, то есть они распространены на все ферменты,
независимо от источника их получения.
Со времени выделения Дж. Б. Самнером в 1926 г. уреазы в
кристаллическом виде несомненно признавалось, что все фермен­
т ы — это простые или сложные белки. В 1981—1982 гг. Т. Р. Чех
с сотрудниками открыл каталитическую активность у рибонукле­
иновой кислоты. Этим опровергается универсальность принципа
"фермент — это белок", а кроме того привносятся новые концепции
в ранние этапы эволюции живой материи. Некоторые исследова­
тели (Дж. Дарнелл-младший) считают, что первым веществом
наследственности была РНК, а не ДНК, поскольку ей присуща
61
большая функциональная универсальность — она способна хра­
нить информацию, воспроизводиться, направлять синтез белка и
вести себя как фермент. Вместе с тем следует оговориться, что
диапазон реакций, катализируемых РНК, еще недостаточно велик,
чтобы указанное выше опровержение принималось сегодня в
"конкурентный расчет".
В отличие от небиологических катализаторов ферменты —
высоко специфичны, они имеют активные центры, многие из них
проявляют свою активность в присутствии коферментов (коэнзи-
мов) небелковой природы, то есть в таких случаях ферменты
являются сложными белками. К сожалению, до сих пор нет
достаточной четкости в определениях коферментов и кофакторов.
Одни авторы отождествляют эти понятия, другие используют лишь
один термин — коферменты, третьи выделяют ионы некоторых
металлов в разряд активаторов, прямо не связывая их с кофермен-
тами, и т. д. Накопленный фактический материал служит веским
основанием подразделять белки-ферменты на две группы — про­
стые ферментные белки и сложные ферментные белки, из которых
сложные содержат в своем составе неорганические и/или органи­
ческие небелковые структуры — коферменты. Коферменты могут
обратимо или необратимо (простетические группы) связываться с
белковой частью — апоферментом. Полный ферментный комплекс
называют холоферментом. Если ж е действие некоторых фермен­
тов лишь активируется неорганическими ионами или атомами
металлов и не снимается полностью в их отсутствии, то такие
активаторы следует называть кофакторами.
Функции контакта с субстратом и катализа у простых фермен­
тных белков выполняют боковые радикалы аминокислот в пол­
ипептидной молекуле; в сложных ферментных белках эти функции
выполняют преимущественно коферменты.
Коферменты классифицируют по каталитическим и структур­
но-функциональным признакам. Например, коферментами окси-
до-редуктаз являются: НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, липоевая кислота
и др.; коферментами трансфераз-пантотенат, УДФ-глюкоза, ЦДФ-
холин, тетрагидрофолиевая кислота и др. Ряд коферментов явля­
ются производными витаминов: тиамина (декарбоксилазы ос-кето-
кислот, транскетолазы), рибофлавина (ФМН, ФАД), пантотеновой
кислоты (кофермент А), никотинамида (НАД, НАДФ) и т. д. Отсюда
62
понятна необходимость отдельных витаминов в питательных сре­
дах для биообъектов.
Достаточно много ферментов (порядка 25%) относится к метал-
лоферментам, представляющим собой одну из групп металлобио-
молекул.
Такие ферментные белки без металлов не проявляют фермен­
тативной активности. В тех же случаях, когда ионы металлов не
выполняют роли коферментов (металлы-кофакторы), а лишь акти­
вируют ферментативные реакции, то такие ферменты по сути

Металлобиомол

Ферментные белки Транспортные и Небелковые молекулы

аккумулирующие белки
i
Оксщ\оре^уктазы Переносчики Фотовосстанав -
Оксидазы электронов _лив.ающие.
(Fe,Cu,Mo) Цитохромы (Fe) Хлорофилл (Мд)
Дегидрогеназы Fe-S(Fe)- белки и Фотосистема II
(Fe.Cu.Mo) Си —белки (Мп,Мд)
Гидроксилазы
(Fe,Cu,Mo) Транспортирующие
Оксигеназы металлы и структур —
(Fe) ^кущлнрующие,
Супероксид— JUaBcnQKraweii Сидерофоры (Fe)
дисмутаза £4>улурцые Скелетные (Ca.Si)
(Cu,Zn,Mn) Ферритин (Fe)
Нитрогеназы Трансферрин (Fe)
(Fe.Mo) Церулоплазмин (Fe)
Гидрогеназы
(Fe)
Связывающие 0 2
Гидролазы Миоглобин (Fe)
Карбоксипепти — Гемоглобин (Fe)
даза (Zn) Гемеритрин (Fe)
Аминопептидазы
Гемоцианин (Fe)
(Mg.Mn)
Фосфатазы
(Mg,Zn,Cu)

Изрмер§зы^_сицтетазы

Коэнзимы (Со) — белки

63
своей не являются металлоферментами. Их следует называть ме-
таллоактивйрованными ферментами.
Можно утверждать, что в металлоферментах ионы металлов
выполняют и каталитическую и структурную роли, тогда как в
металлоактивированных ферментах — преимущественно катали­
тическую. Тем не менее металлы в качестве коферментов и
кофакторов в какой-то части сходны в своих функциональных
проявлениях. Для металлоактивированных ферментов возможны
4 схемы трехчленных комплексов, участниками которых являются
фермент (Ф), субстрат (С) и металл (М) в стехиометрическом
соотношении 1:1:1.
М
1) Ф—С—М, 2) Ф—М—С, 3) М—Ф—С, 4) Ф <^ [
С
В первой схеме мостиковое положение занимает субстрат, во
второй — металл, в третьей — фермент и в четвертой — металл в
циклическом комплексе. Металлоферменты, например, не форми­
руют комплекс Ф—С—М, так как при очистке они выявляются в
форме Ф—М.
Металлоферментами являются так называемые геминовые
ферменты (каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза), в составе
которых имеется простетическая железопорфириновая группи­
ровка, или гем; трансферазы, у которых коферментная форма
витамина Вп представлена 5'-дезоксиаденозилкобаламином.

Все ферменты с коферментом Bi2 катализируют реакции об­

мена водорода, связанного с углеродом, на какую-либо иную
64
 Витамин Bi2

группу (алкильную, аминную, гидроксильную, карбоксильную).

Другая коферментная форма витамина Bi2 — метил-кобаламин
(группа CN в коррине замещена метилом) участвует в реакциях
переноса метильных групп. Кофермент Bi2 в определенной степени
сходен с гемом, однако вместо железа в нем содержится кобальт.
В настоящее время стали известны и новые коферменты.
Например, корфин (фактор 430) представляет собой никельтетра-
пиррол и напоминает рассмотренные выше макроциклические
структуры гема и коррина. Корфин выступает коферментом окси-
доредуктаз у метанобразующих бактерий, связанных с окислитель­
но-восстановительным превращением одноуглеродного субстрата.
65
3 т. 8524
 С£ОЬ1 О
н
< HN]
•снз
снЛ- ,.N=a н
соон
\
NiЧ
н
"7~ чУ^сс
H--J / *н
соон 1н
^ 0
Sсоон
кофермент F 4 3 0 , ипи корфин

В метанообразующих бактериях найдены также фактор 420,

оказавшийся гидридным донором, и фактор, восстанавливающий
диоксид углерода.
У метилотрофных бактерий, окисляющих метан, обнаружен
кофермент метоксатин, содержащий в своей молекуле ортохино-
новую простетическую группу. Оксидоредуктаза — глюкозодегид-
рогеназа Acinetobacter calcoaceticus содержит сходную ортохино-
новую простетическую группу. Вот почему такие ферменты пол­
учили название хинобелки.
о сн 3 о соо-
он
-0^-о'УуЛнА/\00-
О" О СОСГ

фактор 420 - гидридный донор

СОСг

ортохиноновая группа в метокеатмне

66
 фактор, восстанавливающий 0(¾

Механизм действия этих коферментов точно пока неизвестен.

Кофакторами в металлоактивированных ферментах часто вы­
ступают ионы магния, цинка, кальция, то есть металлы с постоян­
ной валентностью. Например цинк активирует алкогольдегидроге-
назу, щелочную фосфатазу; кальций - сс-амилазу; магний — АТФ-
азу, гексокиназу и многие другие ферменты; марганец (или магний)
— енолазу; калий — пируваткиназу, и т. д.
Из сказанного о металлоферментах и металлоактивированных
ферментах следует, что наличие определенных ионов в среде
культивирования биообъектов строго обязательно.
Кинетические характеристики биокатализаторов, определяю­
щие активность и длительность работы ферментов в различных
условиях, являются важными показателями и при промышленном
получении ферментов. Все эти данные подробно рассматриваются
в курсе биохимии. Здесь же мы останавливаемся лишь на важней­
ших параметрах, без которых биотехнология ферментов будет
недостаточно охарактеризованной.
В процессе биокатализа активность ферментов и, следователь­
но, их каталитические функции снижаются. Кажущаяся структур­
ная громоздкость их в нативном виде (от лат. nature — природа) с
лихвой компенсируется эффективностью катализа, если сравни­
вать их с неорганическим ("простыми") катализаторами. Однако в
изолированном виде ферменты достаточно легко инактивируются,
что приобретает важное значение для практики. Отсюда возникает
проблема стабилизации активности ферментов в случаях их про­
мышленной эксплуатации. Следует заметить, что in vivo инактива­
ция и активация ферментов, равно как и синтез их de novo или
denuo (по-лат. — заново), регулируется самим организмом. К тому
же в организме (клетке, ткани) многие ферменты находятся в
связанном состоянии. Очевидно, что при этом их конформации
больше или меньше изменяются, что не безразлично для клетки с
67
функциональной точки зрения. Из практической работы известно
немало случаев, когда неполностью очищенные ферменты были
какое-то время активнее и стабильнее чистых образцов биоката­
лизаторов. На этом основании можно предполагать, что так назы­
ваемые примеси создавали благоприятное окружение ферменту и,
очевидно, выгодное потребителю. Стабилизация ферментов могла
быть обусловлена разными факторами, например, иммобилиза­
цией на мембранных структурах, соединением с высокополимер­
ными углеводами или гликоконъюгатами и пр. Подобная стабили­
зация сродни консервации белковой молекулы, так как здесь речь
идет о сохранении фермента какое-то (обычно более или менее
длительное) время со всеми присущими ему параметрами.
В любом случае при получении ферментов в производстве
необходимо опираться на воспроизводимые результаты, заложен­
ные в регламенте.
Активность и стабильность — как параметры важны и для вновь
внедряемых в производство ферментов, поскольку предполагаемая
их "выходная активность" приобретает существенное значение с
точки зрения выбора (или проектирования) конструкции реактора,
оснащении его необходимой контрольно-измерительной аппарату­
рой и т. д. (в частности, для исключения быстрой инактивации
фермента).
Активность биокатализаторов измеряют в международных еди­
ницах (ME) — 1 ME соответствует количеству фермента, превра­
щающему 1 микромоль (мк/моль; 10"6 моль) субстрата в 1 мин. в
стандартных условиях. Единицы активности могут быть выражены
в мкЕ, нЕ и пЕ, то есть соответственно в микро-, нано- и пикоеди-
ницах с учетом превращения 10 е , 10"9 или 10"12 моля субстрата в 1
мин. Удельную активность выражают в единицах на 1 мг белка. С
1973 г. введена единица ферментативной активности катал (кат.),
соответствующая количеству катализатора, способного превра­
щать 1 моль субстрата в продукт за 1 секунду. Тогда соотношения
катал и ME будут следующими: 1 к а т = 1 моль субстрата • С"1 = 60
моль» мин"1 =60*10 6 мкмоль» мин"' = 6«107 ME, 1 М Е = 1 мкмоль*
мин*'= 1/60 мкмоль*с"'= 1/60 м к к а т = 16,67 н к а т = 16670 пкат. Все
это косвенно подтверждает факт трудности выделения ферментов
в чистом виде и на практике приходится чаще иметь дело с группой
белков в продукте — сырце или в исходном материале, или,
наконец, в других партиях материала, подлежащих разделению.
В лабораторных и производственных условиях нередко прихо-
68
дится иметь дело с денатурацией ферментов в зависимости от ряда
факторов, например, биологических — гидролиз целевого продукта
какой-либо пептид-гидролазой, находящейся в исходном сырье или
привнесенной случайно, например, при микробном загрязнении;
физических — неадекватное температурное, механическое, ради­
ационное воздействия; химических — рН, комплексообразовате-
лей, растворителей, ионогенных поверхностно-активных веществ,
тяжелых металлов и т. д.
Естественно, что от качества выделения и очистки фермента
зависит надежность анализа его структуры. Тем не менее, следует
помнить, что одинаковые ферменты, выделяемые из различных
источников, могут иметь разные аминокислотные последователь­
ности и, следовательно, они не тождественны — их каталитическая
активность и свойства будут различными. В качестве примера
можно назвать вид Вас. coagulans, образующий глюкозоизомеразу;
этот фермент активируется ионами Со 2 + , а такой ж е фермент,
продуцируемый мутантом данного вида при рН более 8, не нуж­
дается в ионах кобальта. Вот почему точность имеющейся инфор­
мации об источнике фермента, его технологии, паспортных данных
приобретает исключительную важность при сравнении фермента,
выпущенного разными фирмами-изготовителями.
М. Левитт и К. Чотиа в 1976 г. подразделили структурно
известные белки по наличию и расположению ос-спиралей и
Р-слоев на пять классов:
I — белки, состоящие только и з а-спиралей, уложенных вместе
в глобулярную структуру;
II — белки, состоящие только из (3-слоев и формирующие
глобулу в форме бочонка;
III — белки, включающие ос-спирали и Р-слои (а + Р-белки), но
разобщенные в третичной структуре;
IV — белки сс/р, в которых а- и Р-структурные участки чере­
дуются в первичной структуре, формируя третичную структуру, в
центре которой находятся обычно параллельно уложенные Р-слои,
окаймленные с обеих сторон ос-спиралями;
V — обычно малые молекулы с многими -S—S-мостиками или
ассоциированные с крупным кофактором "неупорядоченные бел­
ки", обладающие слабой вторичной структурой.
На рис. 13 представлены схемы Дж. Ричардсон (1981) для
различных белков, отнесенных к какому-либо одному из пяти
вышеназванных классов.
69
 Рис. 13. Пять классов белков по Дж. Ричардсон
(1981):
А — миохемеритин (класс I),
1Я Б — Си, Zn—супероксиддисмутаза (класс II),
В — лизоцим (а+р-структура, III класс),
Pi Г и Д — две ортогональные проекции НАД—свя­
зывающего домена лактатдегидрогеназы (IV
класс),
Е — тризофосфатизомераза (ГУ класс),
Ж Ж — нейраминидаза вируса гриппа (V класс).
Более или менее длинные цепи белков, как правило, формируют
домены, представляющие собой свернутую в пространстве струк­
туру, имитирующую маленькую белковую молекулу. Доменам
присущи функции связывания, и в ферментных белках активный
центр располагается преимущественно на границе между двумя
или большим числом доменов. К настоящему времени установлено,
что домены способны перемещаться друг относительно друга в
процессе функционирования содержащей их молекулы. В трипси-
ногене домен из неупорядоченного состояния переходит в упоря­
доченное в ходе активации зимогена.
70
 Заметный прогресс в изучении структуры белков начался с
конца 70-х годов текущего столетия. Если до этого структуры их
выводили на основании метода диффракции нейтронов, карт
распределения электронных плотностей с введением в молекулы
белков тяжелых атомов, то в последующие годы были развиты
методы синхронной радиации, методы с использованием компью­
терной техники, что сослужило огромную службу кристаллогра­
фии данных биополимеров. В этой связи статичный метод рентге-
ноструктурного анализа одиночного кристалла способен дать ди­
намичную информацию. На основании указанных методов пока­
зано, например, что фермент лизоцим имеет оболочку из 33—35
прочно связанных молекул воды и менее упорядоченную область
из 95—105 молекул воды, соединенных с белком лишь одной
водородной связью. Около 60—80% остальной воды распределено
в промежутках между кристаллами и не влияет на электронную
плотность белка.
Молекулы белков не являются жесткими структурами — они
подвижны л, следовательно, достаточная лабильность молекул
ферментов (молекулярная вибрация) играет важную роль в узна­
вании субстрата и стабилизации переходного состояния.
Чтобы увидеть ферменты в действии стали использовать метод
рентгеноструктурного анализа при низких температурах (криоэн-
зимология) — можно сделать "стоп-кадры" в кинетически значи­
мых точках катализируемой реакции.
Теперь хорошо известно, что ферменты, внедряемые в про­
мышленность выгодно отличаются от неорганических (или синте­
тических) катализаторов рядом преимуществ, существенным из
которых следует назвать низкую энергоемкость ферментативных
процессов, то есть сравнительно небольшие затраты внешней
энергии. На каталитические процессы в промышленности прихо­
дится 80—90% и доля их продолжает возрастать. В неорганическом
синтезе, например, получают контактным способом десятки мил­
лионов тонн серной кислоты в год. При контактном процессе
окисление SO2 в БОз протекает в присутствии катализатора V2O5
с добавлением К2О и других оксидов.
В органическом синтезе на никелевых катализаторах осущест­
вляют многие реакции гидрирования соединений, включающих
С = С, Са С, С = О, NO2 — группы. Для примера назовем алюмо-
молибденовые, алюмохромовые и алюмоплатиновые катализато­
ры, применяемые для дегидрирования линейных и разветвленных
алканов в олефины. Так, катализаторы на основе оксида хрома,
применяемые в реакции превращения бутана в бутен, работают
при температуре около 600°С, а регенерация их протекает при
640—650°С. Оксидные катализаторы окисления С03О4, СГ2О3, NiO
71
эффективны также при температурах 250—600°С. Лишь отдельные
катализаторы полимеризации (ВЁз) проявляют свое действие при
—80°—100°С, например, при получении полиизобутилена. Однако
чтобы добиться понижения температуры до —80° или —100° С,
также необходима затрата энергии.
Напротив, все биохимические реакции в живых системах
потекают при сравнительно низких температурах. Например, фер­
менты микроорганизмов — сапрофитов, живущих в почве средних
широт нашей страны, относятся к мезофилам, то есть их ферменты
эффективно действуют в пределах от + 10 до +50°С (с преимуще­
ственным интервалом от + 20 до + 30°С). Нечто аналогичное можно
сказать и о ферментах растений. Ферменты животных более
эффективны при нормальной температуре тела.
Тем не менее, следует помнить, что для каждого фермента есть
свои так называемые кардинальные точки температуры, рН и др.
(minimum, optimum, maximum).
Необходимо также отметить и тот факт, что скорости фермен­
тативных реакций при оптимальных условиях многократно превы­
шают скорости реакций, в которых используются неорганические
(синтетические) катализаторы.
Ферменты, с точки зрения энергетики, заметно снижают энер­
гию активации химических реакций. Под энергией активации
понимают количество энергии в Джоулях, необходимое для при­
ведения всех молекул 1 моля вещества при определенной темпе­
ратуре в состояние критического энергетического уровня (пере­
ходный уровень), при котором начинает происходить химическая
реакция. Если не все молекулы вещества достигают переходного
уровня, то скорость химической реакции снижается.
Основные пути повышения скоростей реакции — это либо
использование температурного фактора, либо катализаторов. В
случае применения неорганических или синтетических катализа­
торов необходимо использовать в большинстве случаев высокие
температуры. Как уже было сказано, биокатализаторы эффективно
работают при сравнительно низких температурах. Скорости реак­
ций зависят от концентраций субстратов. Когда фермент насыщен
субстратом, он не может функционировать быстрее — это и есть
максимальная скорость реакции (Vmax), то есть, когда доля свобод­
ного фермента оказывается предельно низкой.
Общая скорость ферментативной реакции должна быть про­
порциональной концентрации фермент-субстратного комплекса
ES (Е — энзим, S— субстрат). Зависимость скорости фермента­
тивной реакции от концентрации субстрата графически представ­
ляется гиперболической кривой (рис. 14). Км на рисунке представ­
ляет собой константу Михаэлиса—Ментен, то есть концентрацию
72
специфического субстрата, при которой конкретный фермент
обеспечивает скорость реакции, равную половине Vmax- До насто­
ящего времени анализ кинетики всех ферментативных реакций
проводят на основе следующего математического уровнения Ми-
хаэлиса—Ментен:
„ _ Ушах [5]
° KM+[S\
где V 0 — начальная скорость при концентрации S, Vmax —
максимальная скорость и К м — константа Михаэлиса—Ментен для
данного фермента, соответствующая определенному субстрату.
Нередко прибегают к преобразованиям уравнения Михаэли­
са—Ментен для получения каких-либо преимуществ при изучению
кинетики ферментативных реакций. В частности, к таким преоб­
разованиям относится уравнение Лайнуивера-Бэрка:
1 _КМ 1 1
V0 ~ Vmax [S] + V-max
Согласно этому уравнению, по графику, построенному в двой­
ных обратных координатах, можно более точно определить V m ax
(рис. 15).
На основании взаимодействия фер­
ментов и специфичных им субстратов, а
также учитывая множество фермента­
тивных реакций в клетке или в организ­
ме, и, наконец, принимая во внимание
другие взаимодействия в биосистемах
(антигены-антитела, токсины и их рецеп­
торы и т. д.), можно говорить о компле­
ментарное™ как основе биологической
специфичности. В большинстве случаев
имеет место молекулярная комплемен- Рис. 14. Зависимость скорости
(V) ферментативной реакции
тарность. Такие взаимодействия проте­ от концентрации субстрата
кают согласно законам термодинамики. (S).
Однако известны взаимодействия фер­ ±
Vo
ментов с другими веществами, кото­
рые сопровождаются снижением i л
полным подавлением активности био­
катализаторов. Вещества, подавляю­
щие ферментативные реакции, назы­
вают ингибиторами (от англ. inhibit —
препятствовать, сдерживать). Они из­
бирательно взаимодействуют с фер­
ментами, например, ЦИанИДЫ, ОКСИД РиС. 15. График двойных обрат
у г л е р о д а , а з И Д н а т р и я ИНГИбируЮТ ОП- ных координат.
73
ределенные окислительно-восстановительные ферменты; иодаце-
тамид, ртутные и мышьяковистые соли блокируют тиоловые фер­
менты; амины, гидразиды и др. взаимодействуют с карбонильной
группой ферментов и, как следствие, ингибируют их активность.
Очевидно, что в живой клетке на принципе "активация-ингибиро-
вание" проявляется и требуемая клетке функциональная актив­
ность в соответствующих условиях существования.
Все ингибиторы подразделяют на обратимые и необратимые:
среди обратимых выделяют к о н к у р е н т н ы е и н е к о н ­
к у р е н т н ы е. Обратимые ингибиторы образуют непрочные
комплексы с ферментами [EI], которые способны распадаться на
исходные компоненты.
Е+ Ю EI
Мерой ингибирования является та концентрация ингибитора,
которая вызывает угнетение фермента наполовину (Iso). Отсюда,
чем меньше величина I, тем сильнее ингибитор, а чем больше I,
тем слабее. В случае взаимодействия необратимых ингибиторов
комплексы [EI] не распадаются и реакция протекает лишь вправо
Е + I - • EI

Конкурентный ингибитор связывается с активным центром

фермента и далее, в отличие от фермент-субстратного комплекса,
не подвергается ферментативной трансформации. Следовательно,
конкурентный ингибитор выступает конкурентом субстрату за
связывание с активным центром. Изменяя концентрации субстра­
та, можно вытеснить и з комплекса ингибитор. Примером конку­
рентного ингибитора сукцинатдегидрогеназы является малонат (в
норме — субстратом выступает сукцинат).
Неконкурентный ингибитор связывается где-то в другом месте
фермента, а не с активным центром. При этом изменяется кон-
формация всей молекулы фермента, сопровождающаяся обрати­
мой инактивацией его каталитического центра. Неконкурентные
ингибиторы взаимодействуют и со свободным ферментом и его
фермент-субстратным комплексом:
E+ I~EI , ES+I«*ESI

Комплексы EI и ESI становятся неактивными.

Из сказанного можно сделать вывод о том, что в работу
ферментов может вмешиваться множество различных веществ, с
помощью которых регулируется их биосинтез и активность. Био­
синтез ферментов будет рассмотрен позднее в этой главе. Что ж е
74
касается регуляции активности биокатализаторов, то, наряду с
большим накопленным материалом в этом направлении, открыва­
ются новые пути обмена, в регуляции которых участвуют фермен­
ты, и познание которых становится насущно необходимым; давно
возникла потребность полнее изучить
взаимодействие между известными ме­
таболическими циклами с определением
роли и механизмов энзиматического ре­
гулирования такого взаимодействия, а
также исследовать глубину участия раз­
личных ферментов в поддержании гоме-
остаза организмов (от греч. oemoios —
подобный, одинаковый, stasis — состоя­
ние, неподвижность), то есть устойчи­
вость их внутренней среды.
Любая живая клетка представляется
устойчивой системой, поддерживаю­
щейся однонаправленным потоком ме­
таболитов (рис. 16).
В зрелых клетках концентрации ме­ отходы
таболитов относительно постоянны.
Гибкость устойчивой системы, каковой Р и с . 16. И д е а л и з и р о в а н н а я
клетка в устойчивом состоянии
является зрелая клетка, подтверждается (ПВ — питательные вещества).
слабыми изменениями и уравновешива­
нием сдвигов, благодаря чему организм
поддерживает постоянство внутренней среды вопреки широкому
разнообразию питательных веществ, качества воды, внешней тем­
пературы и т. д.
При переходе от одноклеточных организмов к многоклеточным
регуляторные механизмы ферментативных процессов существен­
но усложняются, хотя основные концепции приложимы к сущест­
вам любой организации.
В лабораторных или производственных условиях трудно или
невозможно увязать изменение ферментативной активности в
клетке (ткани) с каким-либо одним (из двух) процессом — возра­
станием количества фермента или возросшей эффективностью
биокатализатора. Более определенно можно говорить о повышении
или понижении активности в тех случаях, когда имеют дело с
ферментом в системе (-ах) in vitro, тем более, что большинство
результатов по оценке регуляции их активности получены в таких
системах.
В механизмах регуляции ферментативной активности у эука-
риотических клеток (в отличие от прокариот) существенна роль
физического разграничения (компартментализация) внутреннего
75
содержимого (протопласта). Организация набора ферментов, ка­
тализирующих соответствующую последовательность метаболиче­
ских реакций, в виде макромолекулярного комплекса координи­
рует ферменты и "канализует" интермедиаты (промежуточные
продукты) по данному метаболическому пути. Более того, конфор-
мационные изменения в одном компоненте комплекса может
передаться благодаря белок-белковому взаимодействию другим
ферментам комплекса. Вследствие этого возможно приумножение
регуляторных эффектов.
Велика роль ионов металлов в металлоферментах и металлоак-
тивированных ферментах, в которых аденозин-трифосфат (АТФ)
выступает субстратом. Когда комплекс "АТФ-ион металла" оказы­
вается субстратом реакции, то обычно максимальная активность
наблюдается при молярном соотношении АТФ и металла близким
к единице. При избытке того или иного из этих ингредиентов
отмечается ингибиторный эффект. Поскольку нуклеозидди- и три-
фосфаты образуют стабильные комплексы с дивалентными кати­
онами, постольку внутриклеточные концентрации нуклеотидов
могут влиять на внутриклеточное содержание свободных ионов
металлов и, как следствие, на активность определенных ферментов.
Например, конфигурация глутаматсинтетазы кишечной палочки в
отсутствие ионов металлов релаксирует ("расслабляется") и стано­
вится каталитически неактивной; добавление Мо 2 + или Мп 2 + вос­
станавливает активность фермента.
Каталитическая активность и регуляция активности ферментов
могут протекать в форме мгновенного обратимого ингибирования
по типу обратной связи (Feedback inhibition) с использованием
аллостерических эффекторов небольшой молекулярной массы, не
имеющих структурного сходства с субстратами или коферментами
и связывающимися с аллостерическими сайтами (не активными
центрами) ферментов.

. Ф1 с Ф2 _ ФЗ г Ф4 .
А >Б *В >Г >Д

Это — механизм грубого контроля регуляции активности фер­

ментов. В указанной схеме продукт Д способен связываться с
первым ферментом (Ф1) или ингибировать его. Следовательно, Д
— это отрицательный аллостерический эффектор или Feedback-
ингибитор Ф1 и таким образом может регулироваться синтез Д. В
качестве примера такой регуляции можно назвать ингибирование
триптофаном антранилат-синтетазы у микроорганизмов на пути
76
синтеза триптофана, где промежуточным продуктом является ан-
траниловая кислота.
Различают кумулятивную, мультивалентную (согласованную)
и кооперативную Feedback-ингибиции. В первом случае два или
более конечных продукта ингибируют строго аддитивно один
регуляторный фермент; во втором — два и более конечных про­
дукта находятся в избытке и только при этом условии происходит
полная ингибиция реакции; при кооперативной ингибиции един­
ственный конечный продукт, присутствующий в избытке, тормо­
зит действие регуляторного фермента, но когда, при наличии двух
и более конечных продуктов, торможение заметно превышает
аддитивные эффекты кумулятивной Feedback-ингибиции.
В отличие от Feedback-ингибиции Feedback-репрессия заклю­
чается в том, что производное (дериват) конечного продукта (ре-
прессор) подавляет о б р а з о в а н и е ферментов (а не влияет на
их активность) в данном метаболическом пути:
_У_,е V , r - f c L уЦ (конечный ..
/ 4. продукт)
- репрессор
/
аминокислоты

Регуляторную роль в каталитической активности может играть

так называемая ковалентная модификация, когда к ферменту
присоединяется фосфатная группа (обычно у эукариот) или нук-
леотид (обычно у прокариот). Ферменты, подвергающиеся кова-
лентной модификации, сопровождаю­
щейся модуляцией их активности, на­
зываются интерконвертирующими.
Они существуют в двух активных со­
стояниях — высокой и низкой катали­
тической активности (рис. 17).
В ряде случаев конечный или про­
межуточный продукт используется в ка­
честве активатора какого-либо фермен­
та — это аллостерическая активация
или Feedback-активация.
Наряду с грубой регуляцией актив­
н о с т и ф е р м е н т о в по м е х а н и з м у
Ф-Е НМФ-Е
Feedback-ингибиции известен тонкий Рис. 17. Регуляция фермента­
контроль, в котором ферменты — алло- тивной активности ковалент-
ной модификацией (Е-фермент;
стерические белки имеют не только ка­ НТФ, НДФ и НМФ-соответст-
талитические центры для связывания с венно нуклеозидтри-, ди- и мо­
субстратом, но и близко расположен­ нофосфаты, ФФн-неорганиче-
ные другие места (одно или более), с ский пирофосфат).
77
которыми связываются небольшие молекулы — эффекторы. При­
соединяясь к своему месту, эффектор вызывает конформационное
изменение в ферменте. При этом родство каталитического центра
фермента к субстрату либо уменьшается — наступает аллостери-
ческая ингибиция, либо, напротив, возрастает — наступае*т алло-
стерическая активация (рис. 18).

Рис. 18. Схематичное изображение модификации активного центра (АЦ) фермента

(Ф) с помощью эффектора (Э), взаимодействующего на аллостерическом сайте (А);
S-субстрат, (а)—аллостерическая ингибиция, (б)—аллостерическая активация.

При реализации инженерно-энзимологических процессов важ­

но знать и, следовательно, применять эффекторы на практике.
Вследствие компартментализации клеточных процессов у эукариот
остаются неизвестными концентрации эффекторов (а нередко —
и сами эффекторы) в клетках. Ярким примером здесь служит
фосфофруктокиназа - давно и хорошо изученный фермент глико­
лиза. Оказалось, что она имеет эффектор — фруктоз6-2,6-дифос-
фат, открытый лишь 10 лет назад X. Г. Херсом, Л. Хью и Е. Ван
Шафтин геном.
Очевидно, что во всех рассмотренных примерах регуляции
активности ферментов важное значение имеет чувствительность
биокатализаторов к регуляции, то есть нередко усиление (ампли­
фикация) "сигнала" может оказать решающее влияние на включе­
ние—выключение каскада реакций.
78
 Глава 4
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
В ОБЛАСТИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ
ОРГАНИЗАЦИИ ВИРУСОВ, КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
Чтобы с максимальной продуктивностью использовать биообъ­
ект в биотехнологическом процессе, необходимо знать и учитывать
его структурно-функциональные особенности применительно к
конкретным условиям производства. В большинстве случаев каче­
ство и количество целевого продукта в значительной степени
находятся в прямо пропорциональной зависимости от качества и
количества продуцента. Совершенно очевидно, что подходы здесь
к акариотам, прокариотам и эукариотам должны быть различными,
поскольку первые, например, являются облигатными паразитами
и могут развиваться лишь в живых клетках (тканях); бактерии
структурно менее дифференцированы, чем эукариоты и поэтому
они в большинстве своем менее требовательны к условиям обита­
ния, чем грибные, растительные и животные организмы.
4.1. Акариоты. Ряд бактериофагов, вирусов растений и млеко­
питающих широко используют в биотехнологии, особенно — в
рДНК-биотехнологии (см. ). У них наследственный материал уст­
роен наиболее просто и работа с ним по этой причине несколько
облегчается, хотя понятно, что она на самом деле "ювелирная".
Как уже было сказано в главе 2, вирион представляет собой
нуклеокапсид и архитектоника вирусных частиц не одинаковая
(см. рис. 1а и 226). Многие вирусы животных представляют собой
"голые" нуклеокапсиды (аденовирусы), тогда как другие (вирусы
герпеса и оспы) имеют дополнительную оболочку (суперкапсид),
нередко приобретаемую во время освобождения нуклеокапсида из
клетки организма-хозяина. "Голый" спиральный нуклеокапсид ви­
руса табачной мозаики — ВТМ (вирион) имеет молекулярную
массу (ММ) 39»106 дальтон (Да), а его единственная молекула РНК
— 2,06» 106 Да. Некоторые вирусы имеют двухнитевую РНК, на­
пример, реовирусы, ММ которой равна 9«106 Да.
У большинства вирусов, содержащих ДНК, нуклеиновая кис­
лота является двухнитевой (равно как и у многих бактерио�