Основные принципы работы с культурами клеток

Историческая справка

Техника клеточных культур впервые появилась в начале 20 века [Harrison, 1907; Carrel,
1912] и существовала в течение более чем 50 лет в основном как техника первичных культур
клеток, получаемых из кусочков тканей и органов путем эксплантации. Клетки культивировались
на сыворотке или лимфе. Для пересева клеток и получения клеточных линий использовали
механическое разделение культур клеток. Так было вплоть до 1950-х гг, когда для этих целей
начали активно применять трипсин. Первую линию человеческих клеток (HeLa, клетки рака шейки
матки человека) получил Gey в 1952 году. Именно в это время техника клеточных культур стала
развиваться наиболее активно, в основном благодаря началу эры антибиотиков, что позволяло
избегать микробной контаминации культур клеток. Тогда же начали активно разрабатывать
бессывороточные питательные среды.

Практическое применение

Техника клеточных культур используется для изучения фундаментальных принципов

работы клетки и межклеточных взаимодействий, в протеомике, биотехнологии, для производства
противовирусных вакцин, изучения воздействия лекарственных средств, применяется в
токсикологии. В последние годы все больше внимания уделяется использованию стволовых
клеток в целях регенеративной медицины для клеточной терапии и тканевой инженерии.

Фундаментальные исследования:
Работа клетки: транскрипция, трансляция, синтез белка, клеточный цикл,
дифференцировка, апоптоз
Межклеточные взаимодействия: паракринная регуляция, адгезия, взаимодействие с
матриксом, инвазия, метаболические взаимодействия
Геномика
Протеомика
Прикладное применение:
Биотехнология: использование клеток в качестве продуцентов различных веществ или в
биодеградации
Иммунология: клеточные эпитопы, цитокины, факторы воспаления
Фармакология: действие лакарственных средств, их метаболизм
Токсикология: цитотоксичность, мутагенез, канцерогенез
Клеточная терапия
Тканевая инженерия

Виды культур клеток

Существуют различные виды клеточных культур. На практике чаще всего применяются

нижеперечисленные.

Культура клеток, полученная методом эксплантации. Данный метод получения клеток

наиболее применим в тех случаях, когда выделяемые клетки высокочувствительны к действию
ферментов и легко ими разрушаются.
 Культура клеток в монослое. Это наиболее часто используемый вид культивирования
клеток. При этом клетки не способны к делению не будучи прикрепленными к поверхности,
обладают адгезией к поверхности клеточной посуды и растут до достижения ими плотности
монослоя.

Культура клеток в суспензии. Данная техника используется в основном для

культивирования стволовых клеток крови. При этом следует использовать культуральную посуду с
неадгезивной поверхностью.

Рисунок 1. А - Культура мезенхимных стволовых клеток жировой ткани хомяка в монослое;

Б – эксплантация.

В живой целостной ткани или в органе существуют определенные межклеточные

взаимодействия и взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом. При культивировании
клеток эти взаимодействия нарушаются, и с каждым пассажем свойства культивируемых клеток
все больше отличаются от их свойств в составе живого целостного организма.

С каждым пассажем число быстроразмножающихся клеток растет, а медленно

размножающиеся клетки элиминируются. Особенно заметно ускорение роста клеток после
первого пассажа. К третьему пассажу клеточная линия становится относительно стабильной и
состоит в основном из быстро пролиферирующих клеток.

Нормальные клетки способны к ограниченному числу делений, генетически

предопределяемому длинной их теломер – концевых отрезков ДНК, укорачивающихся при
каждом делении клетки. Исключение составляют гаметы, стволовые и опухолевые клетки,
которые продуцируют фермент теломеразу, восстанавливающую теломеры при каждом делении,
а, следовательно, и увеличивая возможное число делений. Некоторые другие клетки в результате
определенных мутаций также могут давать стабильные клеточные линии, однако большинство
нормальных клеток человека к этому не способны.

Базовые принципы работы с культурами клеток

Участок лаборатории, отведенный под работу с культурами клеток не должен

использоваться для других видов работ или манипуляций с бактериями, грибами и другими
микроорганизмами. Оборудование (СО2 инкубатор, инвертированный микроскоп) и расходные
материалы (серологические пипетки) для работ с культурами клеток должны располагаться с этой
же комнате.
 Работы с культурами клеток должны проводиться в ламинарном боксе II класса
микробиологической защиты, обеспечивающим постоянное поступление фильтрованного воздуха
в рабочую зону.

Все предметы, вносимые в ламинарный бокс должны быть предварительно обработаны

70% этиловым спиртом, таким же образом должна быть обработана и рабочая поверхность
ламинарного бокса.

Персонал, работающий с культурами клеток должен носить чистый лабораторный халат,

вторую обувь и одноразовые резиновые перчатки, которые необходимо обрабатывать 70%
раствором этилового спирта непосредственно перед работой с клетками.

Культуральные среды, сбалансированные растворы, культуры клеток не следует оставлять

в ламинарном боксе открытыми дольше, чем этого требуют проводимые манипуляции. Снятые
крышки следует оставлять на рабочей поверхность ламинарного бокса внутренней поверхностью
вниз, чтобы избежать их случайного загрязнения.

Клеточные культуры содержатся с термостате-инкубаторе при температуре 37˚С в

атмосфере увлажненного воздуха с 5%-ным содержанием СО 2.

Рекомендуется, чтобы каждый исследователь имел свою именную аликвоту среды для
культур клеток. Это позволяет снизить риск и масштабы вероятной контаминации.

Для наблюдения за культурами клеток используется инвертированный микроскоп. Он

отличается от обычного микроскопа тем, что объектив в нем располагается не над, а под
наблюдаемым объектом. Это позволяет наблюдать клетки непосредственно в культуральной
посуде. Необходимо регулярное наблюдение за культурами клеток, что помогает вовремя
заметить изменения морфологии клеток, признаки контаминации, предотвратить перерост
клеток.

Для подсчета количества клеток используют гематоцитометр.

Рисунок 2. Внутри ламинарного бокса: А – Подставка с наконечниками для автоматического
дозатора; Б – Флакон с питательной средой; В – подставка с несколькими автоматическими
дозаторами; Г – Солевой раствор DPBS; Д – Чашка Петри; Е – флакон Т75; Ж – 6-ти луночный
планшет; З – автоматический дозатор для серологических пипеток; И – серологические пипетки
различного объема.

Стерилизация

Проблема контаминации остается одной из основных при работе с культурами клеток.

Различные микроорганизмы, бактерии, грибы, микоплазмы могут быть занесены в культуру
клеток через солевые растворы, пипетки, попасть из воздуха, с рабочих поверхностей, рук
персонала.

Перед работой с культурами клеток необходимо визуально и под микроскопом проверить

культуры на признаки контаминации (помутнение, пожелтение среды, отслоение и гибель клеток,
наличие белых «облачков» грибковой контаминации. Так же необходимо проверить и
используемые культуральные среды и солевые растворы. Их помутнение, наличие осадка –
признак контаминации. Не рекомендуется позволять другим людям использовать вашу
питательную среду. Необходимо постоянно придерживаться принципов асептики и антисептики.

Для предупреждения микробной контаминации все приборы и материалы,

соприкасающиеся с культурами клеток должны быть стерильными. Большинство расходных
материалов является одноразовыми, они поставляются уже стерильными в индивидуальной
упаковке (культуральная посуда, серологические пипетки, центрифужные пробирки,
культуральные питательные среды и компоненты для них, сбалансированные солевые растворы).
Другие же нуждаются в стерилизации.

Стерилизация горячим воздухом. Проводится в сухожаровом шкафу. Рекомендуется для

изделий из металла и термостойкого стекла. Существуют следующие режимы стерилизации
горячим воздухом: 160˚С, экспозиция 150 минут; 180˚С, экспозиция 60 минут (наиболее часто
применяемый); 200˚С, экспозиция 45 минут. Стерильность в двухслойной упаковке в крафт-бумагу
сохраняется в течение 3 суток.

Стерилизация паром под давлением. Стерилизация проводится в автоклавах водяным

насыщенным паром под избыточным давлением. Рекомендуется для изделий из резины,
полимерных материалов (наконечники автоматических дозатороз, пробирки Эппендорфа),
латекса, нетермостойкого стекла, металла. Существуют следующие режимы стерилизации в
автоклаве: 2 атмосферы, температура 132˚С, экспозиция 20 минут (металл, стекло); 1,1 атмосферы,
температура 120˚С, экспозиция 45 минут (латекс, стекло, полимерные материалы). Упаковка в
биксы, обработанные дезинфицирующим раствором и выложенные салфеткой, в двухслойную
упаковку из бязи или крафт-бумагу (два слоя). Сохранность стерильности: невскрытые биксы с
фильтрами – 20 суток, вскрытые биксы с фильтрами – 1 сутки, вскрытые биксы с фильтрами, но с
упаковкой на каждые сутки – 3 суток, невскрытые биксы без фильтров – 3 суток, вскрытые биксы
без фильтров – 6 часов.

Поддержание защиты от контаминации в ламинарном боксе поддерживается регулярным

его облучение жесткими ультрафиолетовыми лучами с помощью встроенной в ламинар УФ-
лампы в течение 20 мин.

Стерилизация жидкостей проводится их автоклавированием в стеклянной или

полимерной таре или путем фильтрации через фильтры с порами 0,22 мкм.

Обеззараживание различных предметов, вносимых в ламинарный бокс, рук персонала

проводится 70˚ раствором этилового спирта.

Таблица 1. Характеристики культуральной посуды

Посуда Объем среды, мл Площадь, Количество

см2 клеток
96-луночные 0,1 мл на 1 лунку 0,3 1*105
планшеты
24-луночные 1 мл на 1 лунку 2 5*105
планшеты
12-луночные 1 мл на лунку 3 7,5*105
планшеты
6-луночные 2 мл на лунку 10 2*106
планшеты
4-луночные 2 мл на лунку 12 5*106
планшеты
3,5 см чашки Петри 2 8 2*106
5 см чашки Петри 4 17,5 4*106
6 см чашки Петри 5 21 5*106
9 см чашки Петри 10 49 1*107
 Флакон Т-10 2 10 2*106
Флакон Т-25 5 25 5*106
Флакон Т-75 20 20 2*107
Флакон Т-125 50 50 5*107
Флакон Т-225 75 75 6*107

При культивировании клеток во флаконах без воздухопроницаемого фильтра, встроенного

в крышку, ее следует слегка открутить. Крышка плотно закрывается каждый раз, когда флакон
выносится из инкубатора. Объем питательной среды, необходимый для культивирования клеток
зависит от площади поверхности сосуда и равен 0,2-0,5 мл/см 2. Не следует превышать данный
объем, т.к. это может привести к нарушению диффузии газов через жидкость к клеткам.

Сбалансированные солевые растворы

Это растворы неорганических солей, содержащие в некоторых случаях бикарбонат натрия

и глюкозу. Эти растворы используются для промывания клеток от среды или растворов
ферментов, для приготовления растворов различных питательных веществ для культур клеток
(добавок аминокислот, гормонов, факторов роста и др.), для промывания и увлажнения тканей и
органов при их препарировании. Чаще всего используются сбалансированный солевой раствор
Дальбекко без ионов кальция и магния и раствор Хэнкса. Растворы без ионов кальция и магния
используются в тех случаях, когда необходимо нарушить целостность монослоя, дезагрегировать
клетки (данные ионы необходимы для агрегации клеток и прикрепления к субстрату).

Таблица 2. Состав наиболее часто используемых солевых растворов

Компоненты DPBS Раствор Хэнкса

2+ 2+
Без ионов Ca и Mg С ионами Ca2+ и Mg2+
г/л мМ г/л мМ г/л мМ
CaCl2 0.2 2.68 0.2 1.80 0.14 1.3
KCl 0.2 1.47 0.2 2.68 0.4 5.4
KH2PO4 0.2 1.47 0.06 0.4
MgCl2 · 6H2O 0.1 0.5
MgSO4 · 7H2O 0.98 3.98 0.1 0.4
NaCl 8 136.9 8 136.9 8 136.9
NaHCO3 0.35 4.2
Na2HPO4 · 2.2 8.06 2.16 8.06 0.09 0.3
7H2O
NaH2PO4 · H2O
D-глюкоза 1 5.5
Феноловый 0.01 0.0
красный

Питательные среды

Питательные среды содержат необходимые для культивирования клеток незаменимые

аминокислоты, соли, витамины, глюкозу в качестве источника энергии. Так же среды обычно
включают в свой состав рН-индикатор феноловый красный (при понижении рН (закислении) цвет
питательной среды меняется с красного на желтый), позволяющий вовремя заметить признаки
перероста клеток, истощения среды, микробной контаминации.
 Изначально различные питательные среды разрабатывались под определенную
клеточную линию, но со временем они получили более широкое применение. К наиболее часто
используемым питательным средам относятся MEM (minimal essential medium), DMEM (Dulbecco’s
modification Eagle’s medium), RPMI 1640, DMEM/F12. Среда МЕМ – наиболее часто используемая
питательная среда, подходящая для культивирования большинства клеточных линий. DMEM была
разработана для культивирования трансформированных клеток, для амплификации вирусов. Она
содержит вдвое больше аминокислот и в 4 раза больше витаминов, а также обладает лучшими
буферными свойствами. Среда RPMI 1640 изначально была разработана для культивирования
клеток в суспензии, однако успешно применяется и для культивирования клеток в монослое,
несмотря на недостаток кальция. Среда F12 была создана для культивирования клеток яичника
китайского хомячка. Сейчас она чаще используется в сочетании со средой DMEM (DMEM/F12) и
применяется для первичных культур клеток. Следует, однако, отметить, что при культивировании
можно адаптировать клетки к росту на другой питательной среде.

Таблица 3 . Рекомендации по выбору питательной среды и сыворотки

Клетки Среда Сыворотка

3Т3 MEM, DMEM CS
Стабильные клеточные MEM, DMEM CS
линии
Фибробласты МЕМ CS
Глиальные клетки MEM, DMEM/F12 FBS
HeLa MEM CS
Гематопоэтические клетки RPMI 1640, α-MEM FBS
Опухолевые клетки DMEM/F12, L15, RPMI 1640 FBS
Кератиноциты α-MEM FBS
L-клетки (L929, LS) МЕМ CS
Лимфобластные линии RPMI 1640 FBS
Эпителий DMEM, DMEM/F12 FBS
Меланоциты М199 FBS
Меланома DMEM, MEM, DMEM/F12 FBS
Мышиная нейробластома DMEM, DMEM/F12 FBS
Нейроны DMEM FBS
Скелетные миоциты DMEM, F12 FBS, HoS
CS – calf serum – телячья сыворотка
FBS – fetal bovine serum – сыворотка плодов коров
HoS – horse serum – лошадиная сыворотка

Эти среды являются неполными. Полными средами называются среды, полностью готовые
для культивирования определенных клеток. Обычно эти среды содержат помимо основной среды
еще и различные нестабильные вещества, ограничивающие срок годности полных сред. К ним
относятся: сыворотка, глютамин, факторы роста, добавки различных аминокислот, пептидов,
нуклеозидов, некоторых солей, гормонов, липидов, ингибиторов и др.
Основным из компонентов полной среды является сыворотка. Чаще всего используется
сыворотка плодов коров, телячья сыворотка, лошадиная сыворотка в концентрациях 5-20%. Чаще
всего используется сыворотка плодов коров в концентрации 10%. Сыворотка содержит
необходимые для роста клеток питательные вещества, различные факторы роста и адгезии,
белки, жиры, гормоны, используется для нейтрализации трипсина. Использование сыворотки в
составе питательных сред позволяет экономически выгодно обогатить их различными
веществами. Однако сывороточные среды имеют ряд недостатков. Сыворотка животных сильно
различается по составу в зависимости от животного и различных физиологических процессов его
организма, следовательно, достаточно трудно проводить стандартизацию состава питательных
сред на основе сыворотки. При хранении сыворотка довольно быстро меняет свои свойства. Срок
ее хранения не должен превышать 1 года при температуре -20 0С. Использование сыворотки
ограничивает применение полученного клеточного продукта в клинической медицине, т.к. он
содержит белки, облагающие иммуногенностью. Так же сыворотка может быть источником
возбудителей различных заболеваний.
Все эти факторы способствовали разработке безсывороточных сред. Эти среды строго
стандартизированы. С их помощью можно селективно поддерживать рост одних клеток и
ингибировать рост других (например, при культивировании меланоцитов можно ингибировать
рост фибробластов и кератиноцитов), поддерживать определенные линии гематопоэтических
клеток и даже определенную фазу их развития за счет использования различных факторов роста и
ингибиторов. Такие среды позволяют переключать процесс пролиферации клеток на процесс
дифференцировки. Также использование безсывороточной среды позволяет снизить
иммуногенность клеточно-терапевтического препарата, применяемого в клинической практике.
Конечно же, такие среды обладают и рядом недостатков. Так, для каждой линии клеток
необходима отдельная среда; факторы роста, гормоны, различные белки, входящие в состав таких
сред достаточно дороги. На бессывороточных средах клетки обычно растут медленнее, возможен
селективные рост части клеток, нетипичных для данной линии. Без сыворотки клетки лишаются
белков, обеспечивающих детоксикацию от метаболитов и растворителей ингридиентов
сыворотки.

Таблица 4. Примеры коммерческих безсывороточных сред

Клетки Среда Производитель

Бронхиальный эпителий LHC-9 Biosource; Clonetics (Lonza);
PromoCell
Фибробласты куриного MCDB 201, 202 Sigma
эмбриона
Эндотелиальные клетки MCDB 130, 131 Cell Applications; Lonza;
Cascade; PAA; PromoCell;
Sigma
Фибробласты MCDB 110, 202, 402 Lonza; Cascade; PromoCell;
Sigma; Stratech; Zen-Bi
Клетки глии Michler-Stucke Lonza; Invitrogen
HEK293 HEKTOR; HEK; Cell Culture Services;
CDM4HEK293 Hyclone;
Millipore—CellGro;
PeproTech
Гематопоэтические клетки, Среда Искова Sigma; Roche Diagnostics
лейкоциты человека
Гепатоциты BD Hepato; Hepatozyme; BD Biosciences; Invitrogen;
Hepatocyte Growth Promocell
Medium, Williams E, L15
Гибридомы Ultradoma; Maxicell; Ex-Cell Atlanta Biologicals; BD
Biosciences; Invitrogen;
Hyclone; Lonza; Sigma
Меланома Gilchrest Lonza; Cascade; PromoCell
Стволовые клетки ESGRO; CellGro; StemLine; Millipore; Clonagen;
StemSpan CellGenix; Sigma; Stem
Cell Technologies

Для работы чаще всего достаточно иметь 2 основных вида полных сред – среду α-МЕМ для
работы с первичными культурами клеток и DMEM для работы с трансформированными
клетками.
Протокол приготовления полной среды на основе α-МЕМ

Компоненты и оборудование

Ламинарный бокс
Стерильные серологические пипетки
Стерильный флакон для питательной среды
Стерильная среда α-МЕМ или DMEM– 440 мл
FBS (fetal bovine serum, сыворотка плодов коров) - 50 мл
100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина – 5 мл стандартного раствора (1 мл
стандартного раствора на 100 мл готовой среды)
2mM L-глутамина (1 мл стандартного раствора на 100 мл среды) – 5 мл или 1 стандартный
флакон сухого вещества

Протокол

Все работы по приготовлению питательных сред проводятся в ламинарном боксе.

Необходимо использование резиновых перчаток. Перчатки и все предметы, вносимые в
ламинарный бокс необходимо обрабатывать 70% раствором этилового спирта.

Сыворотка обычно хранится в замороженном виде в морозильной камере при -20˚С или -
80˚С. Ее необходимо медленно разморозить в холодильнике при 4˚С в течение ночи.

L-глутамин поставляется в виде раствора, который обычно хранится замороженным или в

виде сухого порошка во флаконах, содержащих то количество вещества, которое необходимо для
приготовления 500 мл готовой питательной среды определенного вида (146 мг для сред MEM, 50
мг для среды 199). Раствор L-глютамина необходимо разморозить, тщательно растворить осадок
встряхиванием и пипетированием и использовать из расчета 1 мл L-глютамина на 100 мл готовой
среды (1:100 или 1% по отношению к объему среды). Если L-глютамин поставляется в сухом виде,
к содержимому флакона необходимо добавить 5 мл питательной среды без сыворотки,
тщательно растворить порошок пипетированием. Данный раствор также используется из расчета 1
мл L-глютамина на 100 мл готовой среды. Излишки раствора можно заморозить.

Для приготовления 500 мл полной питательной среды с 10% содержанием FBS

необходимо в ламинарном боксе к 440 мл среды добавить 5 мл раствора L-глютамина, 5 мл
стандартного раствора пенициллина-стрептомицина и 50 мл FBS.

Готовая среда подписывается с указанием на этикетке ее состава, даты приготовления и

имени приготовившего ее сотрудника.

Первичная культура клеток

Первичная культура клеток – растущие клетки, полученные из какой-либо ткани путем

эксплантации, механической или ферментативной диссоциации («клетки до пересева»).

Клеточная линия – клетки, поддерживаемые в культуре путем пересева («клетки после

пересева»).

Получение первичной культуры клеток

 Для получения первичной культуры клеток обычно требуется выделить ткань-источник
клеток, получить клетки путем эксплантации из кусочка ткани или путем ее механической и/ или
ферментативной дезагрегации и поддерживать жизнедеятельность клеток после их высева на
культуральную посуду. Большая часть нетрансформированных клеток для деления требуют
адгезии к поверхности культуральной посуды. Исключением являются стволовые клетки и
гематопоэтические клетки, которые успешно размножаются в суспензии. Опухолевые клетки
зачастую так же способны расти в суспензии.

Выделение ткани

Перед забором ткани следует убедиться в том, что соблюдены все этические нормы и
правила относительно работы с животными, принятые в данной стране и в данном учреждении.

Забор ткани должен проводиться в условиях операционной для животных. Персонал

должен носить чистый халат, вторую обувь, перчатки, шапочку и маску. Не рекомендуется
проводить забор тканей в условиях культуральной лаборатории, т.к. животное может быть
источником различных микроорганизмов. Животное следует умертвить наиболее гуманным
образом, вызывающим мгновенную смерть без длительных мучений. Наиболее
предпочтительными методами являются смещение шейных позвонков и декапитация. Не
рекомендуется использовать методы, основанные на введении различных химических веществ,
средств для наркоза, т.к. химическое воздействие может оказать влияние на клетки.
Операционное поле (а лучше все животное) и перчатки следует обработать 70% раствором
этилового спирта. Забор тканей производится стерильными инструментами. Полученную ткань
или орган помещают в стерильный сбалансированный солевой раствор и в кратчайшие сроки
доставляют в культуральную лабораторию. Если это оказывается невозможным, то можно хранить
выделенную ткань в буферном растворе при +4˚С до 72 часов.

Получение клеток из ткани

В культуральной лаборатории работы с тканями проводятся в ламинарном боксе с

соблюдением всех правил асептики и антисептики.

Существует несколько техник выделения клеток из ткани.

1. Эксплантация. Данный метод был разработан Harrison, Carrel и др. в 1907-1912 гг.
Сейчас он используется в тех случаях, когда имеется небольшой объем тканей и высок
риск потери клеток при механической и ферментативной дезагрегации. Ткань
аккуратно с помощью острого лезвия (уменьшает число погибших клеток) разделяется
на мелкие кусочки примерно около 1 мм3, промывается сбалансированным раствором
и раскладывается на дно культуральной посуды с питательной средой. После этого
излишки питательной среды удаляются так, чтобы верхняя часть кусочка ткани
оставалась не покрытой жидкостью. Это позволяет удержать ткань прижатой к
поверхности чашки за счет сил поверхностного натяжения. Клетки инкубируются при
37˚С в атмосфере увлажненного CO2, при этом желательно как можно меньше
беспокоить чашку. В последующие дни количество питательной среды в чашке
постепенно доводится до нормального объема (после прикрепления кусочка ткани).
Через некоторое время начинается миграция клеток из ткани, вокруг кусочка
наблюдается рост клеток. Затем ткань убирается механически. Основные недостатки
этого метода: низкая адгезия некоторых тканей к пластику и селекция на
 мигрирующие клетки. Для улучшения фиксации кусочка ткани может быть
использовано покрытие чашек полилилизом, фибронектином, помещение эксплантов
в каплю сыворотки с ее последующим свертыванием или придавливание стерильными
покровными стеклами.
2. Ферментативная дезагрегация. Обычно используется после предварительной
механической гомогенизации ткани с помощью скальпеля, ножниц или специального
гомогенизатора. Межклеточные взаимодействия в тканях обусловлены различными
молекулами клеточной адгезии (CAMs – cell adhesion molecules). Многие из них
кальций-зависимые, поэтому для дезагрегации тканей используют растворы, не
содержащие ионов кальция и хелаты, например, EDTA. В состав межклеточного
матрикса входят различные белки (коллаген, эластин, фибронектин, ламинин),
которые чувствительны к протеазам (коллагеназа, трипсин, эластаза, гиалуронидаза,
ДНКаза, проназа), работающим при температуре 37˚С. Для различных тканей может
потребоваться подбор концентрации фермента и времени его воздействия, при
котором достигается оптимальное соотношение между степенью дезагрегации ткани и
количеством выживающих клеток. После дезагрегации ткани, полученные клетки
необходимо отмыть от фермента центрифугированием. Чаще всего для дезагрегации
используется раствор трипсин-EDTA, содержащий 0,25% трипсина и 0,02% EDTA*4Na.
Именно этот раствор используется при пересеве клеток. При этом остатки фермента
ингибируются сывороткой в составе питательной среды или специальными
ингибиторами, например ингибитором трипсина, полученным из соевых бобов.
Ферментативная дезагрегация позволяет получить большее количество более
разнообразных клеток за меньший период времени, не происходит селекции клеток
по способности к миграции. Однако, происходит селекция по устойчивости к действию
ферментов.
3. Механическая дезагрегация. Используется в тех случаях, когда необходимо избежать
воздействия ферментов, селективности метода эксплантации и получить первичную
культуру клеток в короткое время. При этом используются смывы с тонко нарезанных
ломтиков тканей, отпечатки с кусочков тканей и более грубые методы, такие как
пипетирование и продавливание ткани через шприц, сначала без иглы, а затем с
толстой иглой.

Не все клетки, полученные из ткани, могут дать начало первичной культуре. Многие из них
погибают, не способны к адгезии и пролиферации. В случае клеток, культивируемых в монослое,
элиминация таких клеток происходит при первой смене питательной среды. В культурах клеток,
культивируемых в суспензии, погибшие клетки элиминируются по мере пролиферации здоровых
клеток. Так же для суспензионных культур можно применить метод очистки центрифугированием
в градиенте плотности фиколла.

Получение и идентификация первичной культуры мезенхимных стволовых клеток

Использование стволовых клеток представляется в последние годы все более

перспективным направлением в регенеративной медицине.

Аутологичные стволовые клетки в практической медицине предпочтительнее получать из

аспиратов жировой ткани и костного мозга ввиду возможности одномоментного получение
большого количества клеточного материала, малой травматичности процедуры, отсутствия
косметического или функционального дефекта.
 Из жировой и костномозговой ткани могут быть получены мультипотентные стромальные
стволовые клетки, аналогичные мезенхимным стволовым клеткам. Они способны к быстрому
размножению и дифференцировке в различные типы клеток, что открывает широкие перспективы
для использования их в регенеративной медицине – клеточной терапии, тканевой инженерии.

Однако прежде чем новый препарат или метод лечения войдет в широкую врачебную
практику, он должен пройти ряд доклинических исследований на культурах клеток In vitro и
животных in vivo.

Выделение стволовых клеток из жировой ткани и костного мозга

Приборы и материалы

1. Молодая крыса (Rattus Norvegicus).

2. Ламинарный бокс для работы с культурами клеток.
3. Инвертированный микроскоп.
4. Центрифуга, поддерживающая 500 g.
5. Стерильные хирургические инструменты (ножницы, пинцет (желательно по 2 шт)), поддон.
6. Спирт этиловый 70% для обработки животного, рук исследователя, различных предметов,
помещаемых в ламинарный бокс.
7. Стерильный сбалансированный солевой раствор (раствор DPBS или раствор Хэнкса).
8. Стерильная питательная среда для культур клеток:
α-MEM
10% FBS (fetal bovine serum)
100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (1 мл стандартного раствора
на 100 мл готовой среды)
2mM L-глутамина (1 мл стандартного раствора на 100 мл среды)
9. Коллагеназа краба
10. Фильтр с диаметром пор 0,22 мкм
11. Стерильные конические центрифужные пробирки и 10-см чашки Петри

Протокол выделения стволовых клеток из костного мозга

1. Животное умертвить путем смещения шейных позвонков или путем декапитации.

2. Обработать поверхность тела животного 70% раствором этилового спирта.
3. Отсечь конечности животного не повредив диафизов бедренных и плечевых костей (по
суставам).
4. Тщательно, но быстро удалить мягкие ткани с конечностей животного, очищенные кости
промыть стерильным раствором DPBS или раствором Хэнкса.
5. Перенести отпрепарированные кости конечностей в ламинарный бокс. Сменить пинцет и
ножницы на стерильные. Отделить эпифизы бедренных, большеберцовых, плечевых,
локтевых, лучевых костей от их диафизов, вскрыв костномозговую полость.
6. Наполнить 10-20 мл шприц стерильным раствором DPBS или другим сбалансированным
солевым раствором. Ввести иглу в костномозговую полость и под давлением жидкости с
одновременными поступательными движениями внутри костномозгового канала вымыть
из него костный мозг в 50-мл стерильную коническую центрифужную пробирку. Так
поступить со всеми выделенными трубчатыми костями.
7. Полученный костный мозг в солевом растворе центрифугировать 5 мин при 500g,
супернатант удалить.
 8. Клеточный осадок ресуспендировать в питательной среде и тщательно гомогенизировать
пипетированием.
9. Клетки посеять на выбранную культуральную посуду.
10. Инкубировать клетки 24-48 ч, после чего заменить среду, удалив таким образом не
прикрепившиеся клетки (в основном зрелые клетки крови).

Протокол выделения стволовых клеток из жировой ткани

1. Животное умертвить путем смещения шейных позвонков или путем декапитации.

2. Обработать поверхность тела животного 70% этиловым спиртом.
3. Собрать как можно больше подкожной и висцеральной жировой ткани в 50 мл
стерильную центрифужную пробирку с небольшим количеством DPBS или другого
сбалансированного солевого раствора. Вскрытие кожных покровов животного и забор
жировой ткани желательно проводить разными инструментами.
4. Центрифугировать 5 мин при 500g. Дальнейшие манипуляции проводятся в ламинарном
боксе. Отобрать солевой раствор и осадок, содержащий преимущественно клетки крови.
Жировую ткань сохранить.
5. К жировой ткани добавить немного стерильного сбалансированного солевого раствора и
тщательно механически гомогенизировать ткань (ножницами или скальпелем).
6. Центрифугировать 5 мин при 500g. Отобрать солевой раствор и осадок с клетками крови.
Жировую ткань сохранить.
7. Добавить к полученному гомогенизату раствор коллагеназы краба в DPBS. Конечная
концентрация коллагеназы в смеси с жиром 0,2%.
Раствор коллагеназы краба готовится непосредственно перед процедурой выделения
клеток, т.к. при хранении фермент теряет свою активность. Удобно приготовить раствор с
большей концентрацией, а затем разбавить его. Например, приготовить 25 мл 0,4%
раствор коллагеназы краба в DPBS, стерилизовать его путем фильтрации через фильтр с
порами 0,22 мкм. Затем добавить полученный раствор к 25 мл гомогенизированной
жировой ткани. Если гомогенизата получилось меньше, его необходимо довести до
нужного объема (25 мл) путем прибавления стерильного сбалансированного солевого
раствора. Тогда при соединении 25 мл гомогенизированной жировой ткани и 25 мл 0,4%
раствора коллагеназы краба получится раствор гомогенизированной жировой ткани с
содержинием коллагеназы краба 0,2%.
8. Гомогенизат жировой ткани с коллагеназой краба инкубировать 60 мин при 37˚С при
постоянном помешивании (на качающейся платформе).
9. Полученный в результате ферментации раствор центрифугировать 5 мин при 500g. В
результате раствор разделится на 3 фракции: верхняя, белого цвета, содержащая зрелые
адипоциты, средняя, прозрачная, содержащая раствор коллагеназы, и нижняя, бурая,
содержащая различные клетки стромально-сосудистой фракции жировой ткани и остатки
клеток крови. Необходимо аккуратно удалить 2 верхние фракции, сохранив нижнюю,
стромально-сосудистую.
10. Полученная стромально-сосудистая фракция жировой ткани содержит большое
количество коллагеназы, которая разрушает клетки. Поэтому необходимо отмыть
клеточный осадок от фермента. Для этого осадок ресуспендируется с некоторым
количеством стерильного DPBS и центрифугируется 5 мин при 500g. Надосадочная
жидкость удаляется. Пункт 9 повторяется еще 1 раз.
11. Клеточный осадок, отмытый от коллагеназы краба ресуспенидируется в необходимом
количестве питательной среды, производится посев клеток на выбранную культуральную
посуду.
12. Клетки инкубируются 24-48 ч, после чего питательная среда меняется, удаляются не
прикрепившиеся клетки.

Полученные таким образом первичные культуры клеток имеют фибробластоподобную

морфологию и свойства, характерные для мезенхимных стволовых клеток и сохраняют их
на протяжении как минимум 6 пассажей.

Поддержание культур клеток: пассирование, субкультивирование, экспансия,

криоконсервация.

Поддержание культур клеток

Культуры клеток нуждаются в регулярной смене питательной среды для продолжения

своего роста и развития. Частота смены зависит от клеточной линии. Так, быстро растущие
раковые клетки нуждаются в более частой смене питательной среды, около 2 раз в
неделю, медленно растущие первичные культуры клеток, фибробласты нуждаются в
смене питательной среды 1 раз в неделю. Среду следует сменить при изменении ее цвета
на желтый, что говорит о значительном снижении ее рН. Также среда меняется, если
клетки меняют морфологию, появляется вакуолизация цитоплазмы или прекращается
деление. Чем плотнее растут клетки, тем чаще они требуют смены питательной среды.

Протокол смены питательной среды

1. Перенесите в ламинарный бокс культуру клеток и питательную среду, подогретую до

37˚С.
2. Снимите крышку с флакона или чашки и положите ее внутренней поверхностью вниз.
3. Аспирируйте старую питательную среду с поверхности клеточного слоя, стараясь не
повредить его. Если вы делаете это с помощью вакуумного отсоса, то следует сначала
включить его, затем надеть на ручку 1-мл наконечник без фильтра и только затем
аспирировать среду.
4. Откройте крышку флакона с питательной средой и положите ее внутренней
поверхностью вниз. С помощью новой стерильной серологической пипетки наберите
необходимое количество питательной среды и перенесите ее в культуральную посуду
с клетками. Выпускайте среду из пипетки медленно на боковую стенку посуды, чтобы
не нарушить слой клеток.

Со временем клетки первичной культуры (или какие-либо другие культивируемые клетки)

занимают всю поверхность культуральной посуды, что ограничивает их дальнейший рост.
Для продолжения культивирования необходимо пассирование культуры клеток или ее
субкультивирование, благодаря чему клетки получают новую площадь для роста. Для
увеличения количества клеточного материала применяют экспансию. При этом клетки
культивируются в сосуде до достижении монослоя, а затем трипсинизируются,
подсчитываются и пересеваются на дополнительные сосуды, обычно так, чтобы общая
площадь оказалась примерно в 3 раза больше изначальной.

Протокол пассирования клеток

 1. Перенести клетки в ламинарный бокс. Удалить культуральную среду
2. Промыть клетки сбалансированным солевым раствором (DPBS). Для промывания
требуется примерно в 2-3 раза меньший объем раствора, чем используется
культуральной среды для данного сосуда. Данный этап необходим для удаления
сыворотки, которая ингибирует дальнейшую работу трипсина.
3. Добавить в культуру клеток раствор Трипсина-EDTA 0,25%. Требуется примерно в 3-4
раза меньший объем трипсина, чем используется культуральной среды для данного
сосуда. Главное, чтобы трипсин полностью покрывал поверхность клеток тонким
слоем. Инкубировать при 37˚С в течение 5 минут. За это время клетки должны
потерять связь с поверхностью культурального сосуда, потерять отростки, округлиться
и перейти во взвешенной состояние. Процесс открепления клеток контролируется с
помощью инвертированного микроскопа. Если клетки плохо открепляются, можно
слегка постучать сосудом по столу, инкубировать дополнительное время, но в общей
сложности не более 30 мин.
4. Трипсин ингибировать добавлением культуральной среды (содержащей сыворотку) в
объеме в 2 раза превышающем использованный объем раствора трипсина, тщательно
ресуспендировать клетки.
5. На этом этапе можно при необходимости подсчитать количество клеток.
6. Для отмывания клеток от трипсина, перенести их в коническую центрифужную
пробирку, центрифугировать при 500g 5 минут.
7. Удалить супернатант, содержащий трипсин. Ресуспендировать клетки с необходимым
для выбранного сосуда объемом среды.
8. Осуществить посев клеток на выбранный сосуд, равномерно распределив суспензию
клеток.

Подсчет клеток в камере Горяева

1. Покровное стекло укладываем на выступающие части камеры Горяева и притираем к ним,

пока не появятся радужные круги. Вводим в камеру Горяева на границе самой камеры и
покровного стекла 10 мкл клеточной суспензии.

Рисунок 3. Схема камеры Горяева

2. Подсчет клеток производится в 15 больших квадратах, расположенных по диагонали. В

камере Горяева 15 квадратов по горизонтали и по вертикали образуют 15 квадратов по
диагонали.

Это большие квадраты СЧИТАЕМ

НЕ СЧИТАЕМ
Рисунок 4. Схема сетки камеры Горяева

3. Чтобы дважды не сосчитать одни и те же клетки, лежащие на пограничных линиях, следует

соблюдать следующее правило: к данному квадрату принадлежат клетки, находящиеся
большей своей половиной внутри него; клетки, разделенные пограничной линией
пополам, считают только на верхней и левой границе квадрата; клетки, лежащие большей
своей половиной вне данного квадрата не считают вовсе.
4. Подсчитываем количество клеток в 1 мл суспензии по формуле:

Количество клеток
в 15 больших квадратах
по диагонали * разведение * 250 * 1000 = количество клеток в 1 мл
15

Разведение клеточной суспензии используется при подсчете жизнеспособных клеток (клетки

разводятся в красителе) и в том случае, если в клеточной суспензии слишком много клеток, так,
что подсчет их оказывается невозможным (клетки сплошь).

Если разведение 1:10, то надо умножать на 10.

Подсчет количества жизнеспособных клеток

Подсчет количества жизнеспособных клеток осуществляется так же в камере Горяева.

1. К 1 мкл клеточной суспензии добавить 9 мкл раствора трипанового синего

(разведение 1:10). Если клеток мало, то можно использовать другие соотношения,
например 5 мкл клеточной суспензии и 5 мкл красителя (разведение 1:2).
2. 10 мкл полученной суспензии клеток и красителя поместить в камеру Горяева. На
общем синем фоне жизнеспособные клетки неокрашенные, погибшие клетки
окрашиваются в синий цвет (за счет повышения проницаемости их мембраны).
3. В камере Горяева подсчитываются только неокрашенные (жизнеспособные) клетки.
Для определения количества жизнеспособных клеток в 1 мл в формулу для подсчета
клеток в параметр «разведение» подставляем разведение. Так, если разведение 1:10
(1 часть клеток на 9 частей красителя), то подставлять надо 10, если разведение 1:2 (1
часть клеток на 1 часть красителя), то подставлять надо 2.

Back pass – процедура, при которой клетки после трипсинизации и отмывки от трипсина
возвращаются на прежнюю культуральную посуду. Это стандартная методика, применяемая для
поддержания культуры клеток. Обычно возвращаются не все клетки, а только их часть, чтобы они
могли и дальше пролиферировать. Для первичных культур клеток, фибробластов возвращается не
менее ¼ клеток, для раковых линий – 1/8 – 1/10 и меньше. Часто при поддержании раковых линий
после трипсинизации клеток и удаления их с поверхности культуральной посуды, в нее просто
добавляется новая среда. Клетки, оставшиеся на поверхности сосуда, быстро восстанавливают
свою численность.
 Экспансия (субкультивирование) – процедура, направленная на увеличение клеточной
массы (например, для получения клеточно-терапевтического препарата). При этом монослой
клеток трипсинизируют, отмывают от трипсина центрифугированием, ресуспендируют в
необходимом объеме питательной среды и пересевают на клеточную посуду с большей
площадью (обычно в 3-4 раза большей по сравнению с изначальной). Например, если клетки
росли на флаконе Т-25, то 3/4 их следует пересеять на флакон Т-75, а ¼ вернуть обратно, в старый
флакон Т-25 – получается 4-х кратная экспансия.

Криоконсервация клеток

Для длительного хранения клеток, с которыми в данный момент не ведутся какие-либо

работы, используется их замораживание. Для замораживания пригодны здоровые культуры
клеток в состоянии, близким к монослою, без признаков контаминации или истощения
питательной среды. Для хранения клеток в замороженном виде используется специальная среда,
содержащая криопротектор (чаще всего диметилсульфоксид (DMSO)) и повышенное количество
сыворотки.

Среда для заморозки клеток

DMEM

Антибиотик – 1%

L-глютамин – 1%

FBS – 20%

DMSO – 10%

Удобно заранее приготовить некоторое количество среды для заморозки клеток, разделить ее на
аликвоты по 15 мл в конических центрифужных пробирках и хранить при температуре -20 0С - -
800С.

Протокол криоконсервации клеток

1. Перенести клетки в ламинарный бокс. Удалить культуральную среду. Промыть клетки

сбалансированным солевым раствором (DPBS).
2. Клетки трипсинизировать раствором Трипсина-EDTA 0,25% в течение 5 минут при 37˚С.
Трипсин ингибировать добавлением культуральной среды, тщательно ресуспендировать
клетки.
3. Подсчитать количество клеток.
4. Для отмывания клеток от трипсина, перенести их в коническую центрифужную пробирку,
центрифугировать при 500g 5 минут.
5. Удалить супернатант, содержащий трипсин. Клеточный осадок ресуспендировать в среде
для заморозки клеток из расчета 1 мл среды на 1 млн клеток.
6. Перенести клеточную суспензию в криопробирки для хранения клеток из расчета 1 мл
клеточной суспензии на 1 пробирку. Не забудьте подписать пробирки!
7. Равномерно разместить по кругу криопробирки в криокамере, заполненной
изопропиловым спиртом и обеспечивающей постепенное равномерное снижение
температуры пробирок на 10С в минуту.
8. Поместить криокамеру в морозильную камеру с температурой -80 0С. Оставить на ночь.
 9. На следующий день перенести криопробирки в криохранилище с жидким азотом.
Криокамеру согреть до комнатной температуры.

Для удобства ориентировки в криохранилище следует вести журнал, в котором указывается

местоположение клеточных линий и дата их заморозки.

Протокол разморозки клеток

1. Достать криопробирку из ячейки криохранилища и быстро разморозить клетки на водяной

бане при 370С (можно просто согреть в руке).
2. В ламинарном боксе перенести содержимое криопробирки в центрифужную пробирку и
центрифугировать клеточную суспензию 5 мин при 500g.
3. Удалить супернатант, содержащий DMSO. Данный шаг необходим, тк DMSO, обладая
свойствами криопротектора при заморозке клеток, при положительной температуре
оказывает выраженное цитотоксическое действие.
4. Ресуспендировать клеточный осадок в необходимом объеме подходящей питательной
среды и произвести посев клеток на выбранную культуральную посуду.

Идентификация клеток

Принадлежность клеток к той или иной линии или выявление определенных их свойств на
практике чаще всего осуществляется с помощью окрашивания клеток антителами к различным
маркерам, специфичным именно для этих клеток. Так, например, стволовые клетки стромально-
сосудистой фракции жировой ткани, стволовые клетки костного мозга относятся к так
называемым мезенхимным стволовым клеткам. Эти клетки положительно окрашиваются на
следующие маркеры: CD73, CD105, CD90, виментин. Клетки не окрашиваются антителами к CD34,
CD45, CD117, HLA-DR. Для окрашивания используются такие методы как иммуноцитохимия,
позволяющая качественно определить экспрессию определенных маркеров и проточная
цитофлуориметрия, которая позволяет к тому же определить количество позитивных клеток в
образце.

ИММУНОЦИТОХИМИЯ

Иммуноцитохимия – это лабораторная техника определения различных антигенов в

клетке за счет связывания их специфическими антителами [1].

В основе иммуноцитохимических исследований лежит реакция взаимодействия

антитела и антигена. Антигеном могут служить белки, полисахариды, полипептиды, липиды и
нуклеиновые кислоты. Часть молекулы антигена, соединяющаяся с антителом, называется
эпитопом. Так как иммуноглобулины являются крупными белковыми молекулами, то они сами
являются антигенами. При введении иммуноглобулинов в организм животного другого вида
получают антитела к константному домену (Fc). Поскольку Fc фрагмент видоспецифичен, то
полученные антитела являются специфичными ко всем возможным иммуноглобулинам данного
вида животного. Таким способом получают «вторичные антитела». Затем антитела конъюгируют с
флуорохромами или ферментами, полученные антитела называются мечеными [2].

Применять иммунофлуоресцентный метод впервые начал Coons в 1941 году, используя

специфические антитела, меченные флуоресцентной краской (прямой метод).
 Однако широко применять эту методику начали только 20 лет спустя. Позже был
разработан и непрямой метод, при котором антитело, связанное с антигеном клетки,
детектируется с помощью другого, вторичного антитела, которое может быть связано с
флуорофором или ферментом.

Рисунок 5. Схема продукта иммуноцитохимии: А – прямой метод; Б – непрямой метод.

Большим преимуществом является то, что существуют флуорофоры с самыми

разнообразными спектрами эмиссии, что позволяет детектировать сразу несколько антигенов в
одной и той же клетке.

Недостатком этого метода является необходимость использования специального

оборудования для визуализации окрашивания (флуоресцентная микроскоп) и высокий уровень
естественной аутофлуоресценции некоторых тканей, что существенно для иммуногистохимии.

Существуют и другие метки, например, ферментные, когда вторичное антитело

конъюгировано с каким-либо ферментом. Чаще всего используются пероксидаза, щелочная
фосфатаза и глюкозооксидаза [3].

Ферменты визуализируются путем добавления на последнем этапе реакции какого-либо

субстрата. Процесс взаимодействия фермента с его субстратом приводит к образованию
интенсивно окрашенного продукта реакции, который может быть детектирован обычной световой
микроскопией.

С помощью ферментного метода также может быть получено двойное окрашивание.

Например при комбинации пероксидазного метода (коричневое окрашивание) и использования
щелочной фосфатазы, продукт реакции которой может быть различного цвета [4].

Протокол флуоресцентной иммуноцитохимии

Обычно клетки для анализа высеваются на 24-х, 48-ми или 96-ти луночные планшеты и
культивируются согласно условиям эксперимента. Непосредственно само окрашивание возможно
проводить в нестерильных условиях вне ламинарного бокса.

1. Удалить супернатант с поверхности клеточного слоя, промыть лунки достаточным

количеством раствора PBS (около 500 мкл на лунку для 24-х луночного планшета, 200 мкл
для 48-луночного и 100 мкл для 96-луночного).
Далее примерные объемы растворов будут приводиться для 24-х луночного планшета.
Минимально достаточный объем раствора – тот объем, который способен полностью
покрыть поверхность клеточного слоя.
Манипуляции следует проводить быстро, чтобы клетки не засохли в промежутках между
сменой растворов.
2. Фиксировать клетки 200 мкл ледяного раствора метанола в течение 20 мин при -20 0С. Так
же для фиксации можно использовать ледяной ацетон или 4% забуференный раствор
формалина.
3. Промыть клетки трехкратно по 5 минут 500 мкл раствора PBS.
4. Для окрашивания на внутриклеточные антигены инкубировать клетки в течение 20 минут
при комнатной температуре с 200 мкл 0,1-1% раствора Тритона-Х100 для пермобилизации
мембраны (для улучшения проникновения антител через клеточную мембрану). Для
окрашивания на поверхностные маркеры этот шаг не требуется.
5. Промыть клетки трехкратно по 5 минут 500 мкл раствора PBS.
6. Инкубировать клетки с 200 мкл раствора первичных антител в рабочей концентрации (см.
в инструкции) в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при +4 0С,
если не указано иначе.
7. Промыть клетки трехкратно по 5 минут 500 мкл раствора PBS.
8. Инкубировать клетки с 200 мкл раствора вторичных антител в рабочем разведении (см. в
инструкции) в течение 1 часа при комнатной температуре. Если используемые первичные
9. Промыть клетки трехкратно по 5 минут 500 мкл раствора PBS.
10. Для окрашивания ядра инкубировать клетки с 200 мкл раствора DAPI в разведении 1:50
000 в течение 10 минут при комнатной температуре.
11. Промыть клетки раствором PBS и оценить результаты окрашивания на инвертированном
флуоресцентном микроскопе.

Данный протокол может несколько отличаться в зависимости от используемых антител

согласно инструкции фирмы-производителя.

Промышленностью выпускаются первичные антитела, предварительно уже конъюгированные

с флуорохромами (прямая иммуноцитохимия). При их использовании процедура
иммуноцитохимии существенно упрощается, шаги 8-9 опускаются.

Так же возможно окрашивание клеток несколькими антителами. Существует два основных

варианта многоцветного окрашивания.

Параллельное окрашивание – способ окрашивания, при котором клетки инкубируются

сначала со смесью первичных антител, а затем – со смесью вторичных антител. При этом
первичные антитела должны быть выработаны животными различных видов.

Последовательное окрашивание – способ окрашивания, при котором клетки

последовательно инкубируются сначала с первым видом первичных антител, затем с
подходящими к ним вторичными антителами, затем с другим видом первичных антител и
соответствующими вторичными антителами.

Параллельное и последовательное окрашивание можно проводить и с использованием

первичных антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой.

Рисунок 6. Схема иммуноцитохимической реакции при двойном окрашивании

Рисунок 7. Иммуноцитохимия, двойное окрашивание. Зеленый цвет – Alexa Fluor 488, красный
цвет – Alexa Fluor 555, ядра окрашены в синий цвет DAPI.

Проточная цитофлуориметрия

Проточная цитометрия — оптический метод, применяемый для подсчета клеток,

сортинга, определения биомаркеров, при котором суспензия клеток в потоке жидкости проходит
через электронную лазерную систему детекции.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении

через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить
представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень
флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или
внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии [5].

Проточная цитометрия применяется в клинике для выявления различных заболеваний

(преимущественно заболеваний крови) и в широком спектре научных исследований.

Первый прибор для проточной цитометрии, основанный на импедансометрии, был

изобретен Wallace H. Coulter в 1953 году. Первый флуоресцентный цитометр был изобретен
Wolfgang Göhde в 1965 году [6].
 Метод основан на том, что луч лазера определенной длинны волны направляется на
поток жидкости, содержащий суспензию клеток. Детекторы располагаются по ходу лазерного луча
и перпендикулярно к нему, так же имеются флуоресцентные детекторы. Каждая клетка
рассеивает свет лазера и флуоресцентные частицы на ее поверхности изменяют длину волны
испускаемого света. Проточная цитометрия позволяет получить представление об объеме клетки,
частицах внутри клетки (ядро и различные цитоплазматические гранулы) [7].

Подготовка клеток для анализа на проточном цитофлуориметре несколько различается в

зависимости от локализации антигена (на поверхности клетки – мембранные антигены или в ее
цитоплазме – внутриклеточные антигены). Для окрашивания на внутриклеточные антигены
требуется фиксация клеток и пермобилизация их мембраны.

Протокол проточной цитометрии для внутриклеточных антигенов.

1. Работы ведутся с клетками в суспензии, поэтому клетки, растущие на культуральном

пластике, необходимо предварительно трипсинизировать и подсчитать. Количество
клеток, необходимое для анализа может существенно различаться в зависимости от
используемого оборудования.
2. Отмыть клетки от трипсина и питательной среды в достаточном количестве раствора
PBS методом центрифугирования 2 раза по 3 мин при 500 g;
3. Фиксировать клетки в 4% растворе формальдегида 30 минут при комнатной
температуре или каком-либо коммерческом фиксирующем растворе согласно
рекомендациям производителя;
4. Отмыть клетки от формальдегида в растворе PBS методом центрифугирования 2 раза
по 3 мин при 500 g;
5. Пермобилизировать мембрану 0,1% раствором Tween-20 в PBS в течение 10 минут;
6. Отмыть клетки от Tween-20 в растворе PBS методом центрифугирования 2 раза по 3
мин при 500 g;
7. Инкубировать клетки с первичными антителами в растворе PBS в течение 1 часа при
комнатной температуре;
8. Отмыть клетки от первичных антител в растворе PBS методом центрифугирования 2
раза по 3 мин при 500 g;
9. Инкубировать клетки со вторичными антителами в растворе PBS в течение 1 часа при
комнатной температуре;
10. Отмыть клетки от вторичных антител в растворе PBS методом центрифугирования 2
раза по 3 мин при 500 g;
11. Проанализировать результаты на проточном цитофлуориметре.

Для окрашивания мембранных (поверхностных) антигенов пермобилизацию мембраны

не проводят, а фиксацию клеток осуществляют после всей процедуры окраски (постфиксация).
Для анализа поверхностных антигенов этап фиксации является необязательным, однако его
рекомендуется проводить в том случае, если анализируются и сравниваются между результаты
проточной цитофлуориметрии с окрашиванием как на внутриклеточные так и на поверхностные
антигены. Если анализируются только поверхностные антигены, то этап фиксации можно опустить.
 Как и при флуоресцентной иммуноцитохимии, при проточной цитометрии возможно
окрашивание с использованием сразу нескольких антител. Количество и спектр флуорохромов
зависит от параметров прибора, используемого для анализа. Следует отметить, что при
окрашивании одновременно на внутриклеточные и поверхностные антигены, следует проводить
последовательное окрашивание сначала на поверхностные, а затем – на внутриклеточные
антигены.

Однако, не всегда удается определить маркеры клеток данными методами. Чаще всего такая
проблема возникает при использовании клеток редко применяемых в лаборатории животных, т.к.
первичные антитела получают обычно только для самых распространенных видов: мышей, крыс, человека.
В этом случае при работе с мезенхимными стволовыми клетками можно прибегнуть к проверке их
дифференцировочного потенциала. Данная методика несколько менее удобна в первую очередь потому,
что требует много времени (несколько недель), в то время как проточная цитометрия и иммуноцитохимия
выполняются за считанные часы. Для мезенхимных стволовых клеток характерна дифференцировка в
остеогенном, адипогенном, хондрогенном, миогенном, фиброгенном направлениях. На практике наиболее
доступны, часто применяются и являются достаточными для подтверждения принадлежности клеток к
мезенхимным остеогенная, адипогенная, хондрогенная дифференцировки. Для дифференцировки клеток,
полученных из жировой и костномозговой ткани на процесс дифференцировки требуется 21 день.

Протокол остеогенной дифференцировки

1. Клетки высеваются на 24-х луночный планшет из расчета 30 000 клеток на лунку в 0,5
мл обычно используемой для них питательной среды (чаще всего полная
питательная среда α-MEM) и культивируются в течении 48 часов или до достижения
ими монослоя.
2. Заменить питательную среду на среду для остеогенной дифференцировки, а в
контрольных лунках – на контрольную питательную среду. Проводить смену
питательной среды раз в три дня. С 10 дня дифференцировки как в
дифференцировочную, так и в контрольную среды добавляется β-глицерофосфат.

Питательная среда для Контрольная

остеогенной питательная среда
дифференцировки
Питательная среда До 100% До 100%

FBS 10% 10%

дексаметазон 100 нM -
2-фосфат 0,5 μM 0,5 μM
аскорбиновой кислоты
пенициллин 100 Ед/мл 100 Ед/мл
стрептомицин 100 Ед/мл 100 Ед/мл
L-глутамин 2mM 2mM
β-глицерофосфат 0,2 μM 0,2 μM

(с 10 дня
дифференцировки)
 3. Замену питательной среды проводить раз в 3 дня. Культивировать клетки до 21 дня,
после чего провести окрашивание клеток для подтверждения факта остеогенной
дифференцировки.

Реакция von Kossa

Для определения минерализации, являющейся признаком остеогенной

дифференцировки, используют реакцию von Kossa. Эта реакция основана на связывании ионов
серебра с фосфатными группами. Полученное соединение подвергается фотохимической
деградации с выделением ионов серебра, придающим минеральным депозитам серо-
коричневый цвет.

1. Приготовить 2% раствор нитрата серебра в дистиллированной воде. Данный раствор

хранится в темноте при 4˚С в течении 1 недели.
2. Удалить питательную среду из культуры клеток.
3. Фиксировать клетки 4% раствором формалина 30 минут при комнатной темературе.
4. Тщательно промыть лунки достаточным количеством дистиллированной воды 3 раза
по 5 минут.
5. Добавить 2% раствор нитрата серебра в дистиллированной воде, инкубировать в
темноте в течение 10 минут.
6. Инкубировать при ярком свете 1 час.
7. Тщательно промыть лунки достаточным количеством дистиллированной воды.
8. Фиксировать результаты реакции с помощью инвертированного микроскопа.

Протокол адипогенной дифференцировки

Подготовка клеток к адипогенной дифференцировке и последующее поддержание этого

процесса осуществляется аналогично таковому для остеогенной дифференцировки, за
исключением используемых питательных сред. При этом в течение первых десяти дней клетки
культивируются на среде для индукции адипогенной дифференцировки (adipose induction
medium, AIM), а в дальнейшем переводятся на среду для поддержания адипогенной
дифференцировки (adipose maintaining medium, AMM).

AIM AMM (с 10 дня) Контрольная среда

DMEM High glucose До 100% До 100% До 100%
FBS 10% 10% 10%
дексаметазон 1 μM - -
индометацин 100 μM - -
3-изобутил-1- 500 μM - -
метилксантин
инсулин 10 μg/ml 10 μg/ml -
пенициллин 100 мкг/мл 100 мкг/мл 100 мкг/мл
стрептомицин 100 мкг/мл 100 мкг/мл 100 мкг/мл
L-глутамин 2mM 2mM 2mM

Окрашивание Oil Red O и гематоксилином

 Для выявления дифференцировки в адипогенном направлении проще всего
использовать качественную реакцию на нейтральные жиры с красителем Oil Red O,
окрашивающим жировые включения в красный цвет. Ядра клеток окрашивают раствором
гематоксилина в фиолетовый цвет.

1. Удалить питательную среду из культуры клеток.

2. Фиксировать клетки 4% раствором формалина 30 минут при комнатной темературе.
3. Тщательно промыть лунки достаточным количеством дистиллированной воды 3 раза
по 5 минут.
4. Приготовить маточный раствор Oil Red O смешиванием 0,5 г сухой краски со 100 мл
изопропанола и последующим прогреванием на водяной бане до растворения
красителя. Маточный раствор хранится в холодильнике не менее 1 месяца.
Приготовить рабочий раствор, добавляя 20 мл дистиллированной воды к 30 мл
маточного раствора. Клетки инкубировать с рабочим раствором 30 мин, тщательно
промыть дистиллированной водой.
5. Окрашивать ядра клеток гематоксилином в течение 1 минуты, промыть
водопроводной водой в течение 5 минут.
6. Фиксировать результаты реакции с помощью инвертированного микроскопа.

Хондрогенная дифференцировка

Для хондрогенной дифференцировки используют технику Micromass cell culture[1].

Взять 9*105 клеток 3-6 пассажа для дифференцировки и столько же для контроля, отмыть
от питательной среды и осадить. 9*105 клеток для дифференцировки ресуспендировать с 90 мкл
питательной среды для хондрогенной дифференцировки, такое же количество клеток
ресуспендировать с 90 мкл контрольной среды. Наносить по 3 капли по 10 мкл суспензии в
дифференцировочной среде на каждую из 3-х лунок 24-х луночного планшета, то же самое делать
и с контрольной суспензией. Инкубировать клетки при 37 0С 2 часа для прикрепления клеток, после
чего добавить по 500 мкл соответствующей среды в каждую лунку. В качестве контрольной среды
использовать α-MEM с добавлением 10% FBS, 0,5 μM 2-фосфата аскорбиновой кислоты, 100 Ед/мл
пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2mM L-глутамина. В качестве хондрогенной среды
использовать среду DMEM-High glucose с добавлением 10% FBS, 0,5 μM 2-фосфата аскорбиновой
кислоты, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2mM L-глутамина, 1хITS, 100 μM/л
пирувата натрия (ПанЭко), 1 μM дексаметазона, 0,5 μM 2-фосфата аскорбиновой кислоты (Sigma,
США), 10 нг/мл TGF-β1.

Анализ дифференцировки.

Осуществляется ежедневное прижизненное наблюдение за культурами клеток с

помощью инвертированного микроскопа AxioObserver Z1 (Carl Zeiss, Германия) методами фазово-
контрастной и световой микроскопии. Питательные среды меняют 2 раза в неделю.

Для выявления хондрогенной дифференцировки проводят окрашивание на кислые

мукополисахариды, являющиеся маркером хондрообразования. Для этого фиксированные в

1
Solursh M. Chondrogenesis: In vitro Approaches Pathol / Immunopathol. Res. – 1988. – Vol. 7: – P. 48-
50 (DOI: 10.1159/000157092)
течение 30 мин 4% забуференным раствором формалина клетки промывали 200 мкл PBS
трехкратно по 5 минут, окрашивали в течение 1 часа раствором Alcian Blue (1г Alcian Blue на 100 мл
0,1 M HCl) и снова тщательно промывали PBS.

1. VanNoorden, S.a.P., J. M. , ed. Immunocytochemistry today: techniques and practice. Practical

Applications in Pathology and Biology. 1983, Wright PSG: Bristol, England.
2. М.В., У., ed. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. 1991, Мир: Москва.
3. Nakane, P.K. and G.B. Pierce, Jr., Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the
localization of antigens. J Histochem Cytochem, 1966. 14(12): p. 929-31.
4. Campbell, G.T. and A.S. Bhatnagar, Simultaneous visualization by light microscopy of two
pituitary hormones in a single tissue section using a combination of indirect
immunohistochemical methods. J Histochem Cytochem, 1976. 24(2): p. 448-52.
5. Shapiro H.M., A.R.L., ed. Practical Flow Cytometry. 1985: New York.
6. Givan, A.L., ed. Flow Cytometry: First Principles. 2001, Wiley, John & Sons, Incorporated.
7. Brown, M. and C. Wittwer, Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology.
Clin Chem, 2000. 46(8 Pt 2): p. 1221-9.