– Corynebacterium diphtheriae

Ставропольская Государственная Медицинская Академия

Кафедра микробиологии иммунологии и вирусологии

Лекция для студентов специальностей: лечебное дело, педиатрия, стоматология

Раздел: частная микробиология, иммунология, вирусология

Лекция № 12 Дифтерия (Corynebacterium diphtheriae)

Возбудитель дифтерии – представитель семейства коринебактерий

Биологические свойства
Факторы патогенности Corynebacterium diphtheriae
Дифтерийный токсин – генетический контроль его образования
Патогенез дифтерии
Антитоксический иммунитет
Бактерионосительство
Методы лабораторной диагностики Corynebacterium diphtheriae
Специфическое лечение и профилактика
Определение постпрививочного иммунитета
Профилактика осложнений при лечении противодифтерийной
антитоксической сывороткой.

Лекция обсуждена на
совещании кафедры
« »____________ 2008 г
Таран Т.В.

Ставрополь, 2008 г.
 – Corynebacterium diphtheriae
1 Коринебактерии (род Corynebacterium)

Возбудитель дифтерии Corynebacterium diphtheriae (палочка Клебса-

Лёффлера) - представитель рода Corynebacterium, в котором он является
типовым видом. Название рода происходит от греч. korine – булава и bacte-
ria – палочка, что связано с морфологическими особенностями
микроорганизмов.
Род образуют прямые или слегка изогнутые палочки с неравномерно
окрашивающимися участками (некоторые клетки по Граму окрашиваются неравномерно и
имеют вид чёток); размером 1,5-8,0×0,3-0,8 мкм, с заострёнными или, иногда,
булавовидными концами. Иногда содержат метахроматические гранулы (полиметафосфат
– гранулы волютина), расположенные чаще на концах; спор не образуют; неподвижны;
имеют микрокапсулу. В клеточной стенке имеются специфические липиды (эфиры
кориномиколевой и кориномиколеновой кислот, димиколат трегалозы, фосфатиды
маннозы и инозита). У патогенных видов в состав пептидогликана входит мезо- α-
диаминопимелиновая кислота и полисахариды. Цитоплазма содержит липиды, крахмал.
Неподвижны, кислотонеустойчивы. Факультативные анаэробы (лучше растут в
аэробных условиях, образуя плёнку на поверхности жидких сред). Требовательны к
составу ПС; каталаза-положительны, на кровяных ПС непостоянно вызывают гемолиз,
но не образуют гемолизин. Некоторые виды продуцируют экзотоксины. Большинство –
облигатные паразиты слизистых оболочек, включают патогенные и условно-патогенные
для человека виды. Также выделяют патогены животных и растений и сапрофитные виды.
2
Дифтерия – это острая, антропонозная, воздушно-капельная,
токсинемическая инфекция, которая характеризуется развитием
воспалительных изменений слизистых оболочек ротоглотки и верхних
дыхательных путей, а также слизистых оболочек половых органов, глаза,
сопровождающихся образованием плотно спаянных с подлежащими тканями
фибринозных плёнок, на фоне симптомов специфической интоксикации
макроорганизма.
Название заболевания происходит от греч. diphthera – пленка,
перепонка, кожа, что обусловлено клиническими проявлениями данного
заболевания. Возбудителем дифтерии являются токсигенные штаммы
Corynebacterium diphtheriae. Заболевание известно очень давно, имеются
описания, датированные I веком до н.э. Возбудитель дифтерии был
обнаружен в 1883 г. Э. Клебсом в срезах дифтерийных пленок, снятых с зева
больных, а затем в 1884 г. выделен в чистой культуре Ф. Лёффлером. Вид C.
diphtheriae гетерогенен по морфологическим, культуральным,
биохимическим, антигенным свойствам и токсигенности.
3
 – Corynebacterium diphtheriae
Эпидемиология. Дифтерия относится к антропонозным
заболеваниям. В естественных условиях ею болеет только человек, не
обладающий устойчивостью к возбудителю и антитоксическим иммунитетом
(содержание в крови антитоксина по методу Иенсена ≤ 0,03 АЕ/мл).
Резервуар инфекции – человек (больной, реконвалесцент, бациллоноситель);
наибольшую эпидемическую опасность представляют больные лица,
поскольку они наиболее интенсивно выделяют микроб в окружающую среду.
Значительная часть заболеваний возникает в результате заражения от
носителей токсигенных штаммов. У этих лиц нет клинических проявлений,
поскольку они обладают антитоксическим иммунитетом. У
реконвалесцентов выделение возбудителя происходит в течение 15-20 сут
(м. до 90); частота носительства в разных популяциях варьирует в пределах
1-10 %.
Основной путь передачи – воздушно-капельный; благодаря
устойчивости возбудителя в окружающей среде, определенное значение в
передаче инфекции имеют воздушно-пылевой и контактно-бытовой пути
передачи; также возможно заражение через инфицированные продукты
(молоко) – алиментарный путь передачи инфекции. При дифтерии кожи и
ран имеют место контактный и трансмиссивный (в тропиках) пути
передачи.
Пик заболеваемости приходится на осенне-зимние месяцы;
периодичность эпидемических вспышек составляет 7-9 лет.
4
Устойчивость возбудителя во многом зависит от условий внешней
среды. При комнатной температуре во влажной среде он сохраняется
достаточно долго; при 60 С – отмирает в течение 10 мин. В высушенных
пленках выдерживает температуру 98 С в течение 1 ч, а при комнатной
температуре может сохраняться в пленках до 7 мес. На игрушках сохраняется
2 нед. В трупах сохраняет морфологию не более 15 сут., в пыли – до 5 нед., в
воде и молоке – до 6-20 сут, на рассеянном свету остается жизнеспособным
до 8 ч.
Дезинфектанты и антисептики быстро инактивируют бактерии: 3 % р-р
лизола вызывает гибель в течение 10 мин, этанол – за 1 мин, 1 % р-р Н 2О2 – за 2-3 мин, 2-3
% р-р хлорамина и 5 % р-р фенола – в течение 5-10 мин.
Морфология и тинкториальные свойства. C. diphtheriae – тонкие,
слегка изогнутые или прямые грам(+) палочки размером 1-6×0,3-0,8 мкм.
Они утолщены на концах за счет наличия зерен волютина (зерен Бабеша-
Эрнста) на одном или обоих полюсах клетки, что придаёт им вид булавы
или булавки. Благодаря зёрнам волютина, состоящим из полифосфатов, для
 – Corynebacterium diphtheriae
C. diphtheriae характерно неравномерное окрашивание клеток, т.к. зёрна
волютина воспринимают любой анилиновый краситель более интенсивно,
чем цитоплазма клетки, и, вследствие присущей им метахромазии,
приобретают необычный цвет.
Зерна волютина легко выявляются при окраске препаратов
метиленовым синим по Лёффлеру, а также при окраске по Нейссеру в виде
гранул тёмно-синего или сине-черного цвета соответственно. Они резко
контрастируют с бледно-синим или светло-коричневым фоном микробной
клетки. При окраске по Граму зёрна волютина выявить не удаётся. При
люминесцентной микроскопии зёрна окрашиваются корифосфином в
оранжево-красный цвет, в то время как тела бактерий – в желто-зеленый
цвет.
Дифтерийная палочка не обладает кислотоустойчивостью, неподвижна,
спор и капсул не образует; на поверхности имеет фимбрии, облегчающие
адгезию к эпителию слизистой оболочки; имеет микрокапсулу с входящим в
её состав корд-фактором. Клеточная стенка у C. diphtheriae имеет сложное
строение. Она состоит из биоматериала, уложенного в 9 слоёв, и содержит
вещества пептидополисахаридной природы, в состав которых входят
галактоза, манноза, арабиноза. Как и микобактерии, содержат в составе
клеточной стенки большое количество липидов, в том числе
некислотоустойчивые коринеформные миколовые кислоты.
6
Для C. diphtheriae характерен полиморфизм размеров и формы.
Благодаря разламывающему механизму деления, клетки не расходятся и
располагаются в мазках под углом, напоминая латинские буквы L, X, V, Y
или растопыренные пальцы рук, за что их называют «булавовидными
двукрылками». Наличие поверхностных липидов способствует образованию
скоплений плотно прилегающих в результате спонтанной агглютинации
палочек, напоминающих «свалявшуюся шерсть в войлоке» или «пакет
булавок».
Атипичные формы. В большинстве случаев изменения морфологии не
носят специфического характера; развиваются и при культивировании на
теллуритовых средах, что, по-видимому, обусловлено воздействием
теллурита калия на бактерии. В мазках из колоний палочки выглядят
толстыми, короткими и почти не содержат зерен волютина.
В культуре одного и того же штамма наряду с типичными длинными,
изогнутыми и изящными палочками можно обнаружить короткие, толстые, с
вздутиями на одном или обоих концах клетки, а также карликовые,
гигантские или ветвящиеся нитевидные клетки. Полиморфизм чаще
 – Corynebacterium diphtheriae
выявляют на искусственных ПС, содержащих большое количество
сывороточных белков, что способствует несбалансированному росту
бактерий. C. diphtheriae образуют также фильтрующиеся и L-формы.
Полиморфизм клеток имеет дифференциально-диагностическое
значение при проведении идентификации. Так, коринеформные бактерии-
сапрофиты, обитающие на коже и слизистых, располагаются в
микропрепаратах в виде равномерного частокола; зёрен волютина не имеют
или содержат их в большом количестве.
Культуральные свойства. Неоднородность C. diphtheriae находит своё
отражение в культуральных и биохимических свойствах. Возбудитель
дифтерии относится к факультативным анаэробам, культивируется при 37 С,
оптимум рН – 7,4-8,0. Гетеротроф. В отличие от коринеформных бактерий,
на простых питательных средах не растет, т.к. не продуцирует эндопротеазы,
способные расщеплять нативные белки до аминокислот; аминокислоты
усваиваются только из продуктов гидролиза белков – пептонов.
Оптимальные среды для C. diphtheriae должны содержать аминокислоты,
органические источники энергии, источники ионов магния, меди, кальция,
витамины, кровь или сыворотку. Питательная ценность последних
обусловлена наличием в них факторов роста (правовращающая молочная
кислота, никотиновая и пимелиновая кислоты), а не нативных белков,
которые данный микроб не расщепляет. К стимуляторам роста C. diphtheriae
относится также олеиновая кислота.
Для выделения из патологического материала применяется свернутая
кровяная сыворотка (элективная среда Ру) или с добавлением сахарного
бульона (элективная среда Ру-Лёффлера), а также кровяной агар, кровяной
теллуритовый агар (среда Клауберга II), хинозольная среда Бучина, среда
Леффлера, цистин-теллурит-сывороточная среда Тинсдаля-Садыковой. На
элективных средах C. diphtheriae опережает в росте банальную микрофлору и
через 8-14 ч вырастает в виде изолированных точечных, выпуклых
желтовато-кремовых колоний с гладкой или слегка зернистой поверхностью.
Колонии не сливаются, вследствие чего они имеют вид шагреневой кожи.
На теллуритовых средах C. diphtheriae растут медленно (24-48 ч) в
виде черных или черно-серых колоний в результате восстановления
теллурита до металлического теллура, который накапливается внутри
бактерий в виде кристаллов. Возбудитель дифтерии устойчив к высоким
концентрациям теллурита калия или натрия, ингибирующим рост
сопутствующей микрофлоры.
 – Corynebacterium diphtheriae
На среде Бучина через 24-48 ч на месте роста колоний C. diphtheriae
среда приобретает фиолетовый цвет, а колонии окрашиваются в синий цвет.
На среде Тинсдаля-Садыковой возбудитель образует серые или темно-
коричневые колонии, окруженные темно-коричневым ореолом, который
специфичен для C. diphtheriae.
В отличие от коринеформных бактерий, возбудитель дифтерии,
относясь к факультативным анаэробам, растет в глубине столбика сахарного
агара. Коринеформные бактерии образуют поверхностный налёт, т.к.
являются облигатными аэробами.
Биохимические свойства. Возбудитель дифтерии обладает высокой
ферментативной активностью. Все штаммы ферментируют глюкозу и
мальтозу с образованием кислоты и не разлагают сахарозу, мочевину,
лактозу и маннит, восстанавливают нитриты в нитраты (за исключением
биовара belfanti), что свидетельствует о наличии нитратредуктазы, не
продуцируют уреазу и не образуют индол.
Отсутствие способности ферментировать сахарозу и разлагать
мочевину (отрицательная проба Закса, цвет бульона с мочевиной и
феноловым красным не изменяется) является важным дифдиагностическим
признаком, отличающим от микробов-«близнецов».
Другим важным дифференциально-диагностическим признаком
является способность C. diphtheriae продуцировать фермент цистиназу,
расщепляющую цистин или цистеин до сероводорода, который, реагируя с
уксуснокислым свинцом, вызывает почернение столбика сывороточного
агара в результате образования в нем сернистого свинца (положительная
проба Пизу) или образование коричневых ореолов на цистин-теллурит-
7
сывороточной среде Тинсдаля-Садыковой.
образует также каталазу, сукцинатдегидрогеназу,
C. diphtheriae
внеклеточную ДНК-азу, нейраминидазу, гиалуронидазу и др. ферменты.
Возбудитель дифтерии не однороден по культуральным и
биохимическим свойствам. В соответствии с рекомендациями Европейского
регионального бюро ВОЗ вид C. diphtheriae подразделяют на 4 биовара:
gravis, mitis, intermedius и belfanti, что важно с эпидемиологической точки
зрения.
Биовар gravis превосходит все другие биовары по
ферментативной активности. Он ферментирует глюкозу, мальтозу,
крахмал(+) и гликоген. На дифференциально-диагностической среде
Клауберга II и других кровяных теллуритовых средах бактерии биовара
8
 – Corynebacterium diphtheriae
gravis образуют сухие матовые размером 2-3 мм (крупные) плоские серовато-
черные колонии, приподнятые в центре. Периферия колоний светлая с
радиальной исчерченностью и изрезанным, волнистым краем (R-форма
колоний). Эти колонии напоминают цветок маргаритку. На жидкой среде
бактерии данного биовара образуют пленку на поверхности, а также
крошковидный или крупнозернистый осадок. Жидкость остается прозрачной.
Биовар mitis. Бактерии образуют мелкие (2 мм) гладкие
блестящие черные полупрозрачные колонии с ровными краями (S-формы
колоний), окруженные зоной гемолиза. Крахмал (-).На жидкой среде они
дают равномерное помутнение и порошкообразный осадок. На средах Гисса
разлагают лишь глюкозу и мальтозу.
10
Биовар intermedius. Бактерии фактически относятся к варианту
mitis, т.к. не разлагают крахмал (-), хотя ряд авторов считает, что по своим
биологическим свойствам они ближе к биовару gravis. Биовар intermedius
образует изящные плоские темные гладкие колонии со слегка приподнятым
центром и ровными краями (S-формы колоний) или шероховатые колонии с
изрезанными краями (RS-форма колоний). Такие колонии намного мельче
(менее 1 мм), чем у других биоваров. Данные микроорганизмы
ферментируют глюкозу, мальтозу и гликоген. Клетки биовара intermedius
также своеобразны по морфологии. По сравнению с другими биоварами они
наиболее крупные, с бочковидными очертаниями. Примечательной
особенностью является наличие у них внутренних поперечных перегородок,
разделяющих их на несколько сегментов, что не характерно для длинных и
полиморфных палочек биовара mitis, или коротких и полиморфных палочек
биовара gravis. Наиболее четко это обнаруживается при фазово-контрастной
микроскопии в присутствии водного метиленового синего.
11
Биовар belfanti по морфологии колоний и биохимическим
свойствам сходен с биоваром mitis, и длительное время считался его
вариантом. В отличие от биоваров mitis и gravis, он не восстанавливает
нитриты в нитраты. Однако тест на восстановление нитратов, как и
разложение гликогена, не входит в перечень обязательных тестов для
идентификации возбудителя дифтерии.
12
Далее рассматриваются только два культурально-биохимических
варианта – gravis и mitis, так как биовары intermedius и belfanti встречается
редко и по биохимическим свойствам практически не отличаются от биовара
mitis.
Обязательным и наиболее стабильным признаком является тест
на крахмал. По этому показателю все возбудители дифтерии делятся на 2
 – Corynebacterium diphtheriae
биовара: gravis (грубый) и mitis (тонкий). Все штаммы, не ферментирующие
крахмал, относятся к биовару mitis.
Фаготипирование. Более четкую внутривидовую идентификацию
C. diphtheriae можно получить с помощью фаготипирования. Но, несмотря
на важную роль фаготипирования для более глубокого обследования очагов
дифтерии, изучения закономерностей и длительности бактерионосительства,
расшифровки групповых вспышек заболевания и т.д., единых схем
фаготипирования не разработано.
C. diphtheriae образуют также корицины, обладающие узким спектром
действия. Их синтезируют как токсигенные, так и не токсигенные штаммы.
Гены, кодирующие синтез корицинов, передаются плазмидами.
В настоящее время для идентификации применяют ПЦР и
рестрикционный анализ.
Антигенная структура. C. diphtheriae по антигенной структуре также
неоднородны. Их серологическая неоднородность обусловлена
поверхностными термолабильными серовароспецифическими К-антигенами
(белками), а также видовыми и межвидовыми термостабильными липидными
и полисахаридными фракциями О-антигенов, расположенных в глубине
клеточной стенки.
С помощью сывороток к К-антигену C. diphtheriae разделяют на
серовары (около 58). Наиболее сложен в антигенном отношении биовар mitis,
включающий 40 сероваров, в то время как биовар gravis состоит и 14
сероваров. Единой Международной схемы серотипирования C. diphtheriae не
существует. В отечественной практике для определения серовара применяют
развернутую реакцию агглютинации сыворотками. Недостатком
серотипирования является также способность многих штаммов, особенно
нетоксигенных, к спонтанной агглютинации или полиагглютинабельности.
Антигенная изменчивость обусловливает вариабельность и слабую
напряженность антибактериального иммунитета. Следует признать, что
выделяемые культуры неоднородны в антигенном отношении.
Классификация их по серологическим вариантам далеко не окончательна,
остается еще много спорных вариантов, и имеются большие разногласия по
13 определению серологических вариантов бактерий C. diphtheriae.
Факторы патогенности. Главным фактором патогенности
(вирулентности) дифтерийных бактерий является их токсичность (способность
вырабатывать экзотоксин – дифтерийный гистотоксин). Основными
факторами патогенности C. diphtheriae также являются поверхностные

14
 – Corynebacterium diphtheriae
структуры липидной и белковой природы, к которым относится корд-
фактор, вместе с К-антигенами и коринеформными некислотоустойчивыми
миколовыми кислотами, входящими в состав микрокапсулы, ферменты и
токсины.
Поверхностные структуры (ворсинки, фимбрии, пили) способствуют
адгезии микробов в месте входных ворот инфекции, препятствуют
фагоцитозу бактерий, оказывают токсической воздействие на клетки
макроорганизма, разрушают митохондрии.
15
Ферменты. C. diphtheriae образуют ферменты агрессии, колонизации и
инвазии: нейраминидазу и N-ацетилнейраминидазу, гиалуронидазу, а также
гемолизин и дермонекротоксин.
Нейраминидаза и N-ацетилнейраминидаза действуют на
эстафетной основе, обеспечивая бактерии энергетическим сырьём.
Нейраминидаза отщепляет N-ацетилнейраминовую кислоту от
гликопротеинов слизи и поверхности клеток а лиаза расщепляет её на
пируват и N-ацетилманнозамин. Пируват служит готовым источником
энергии, стимулируя рост возбудителя.
Гиалуронидаза. Одним из последствий действия гиалуронидазы
является повышение проницаемости кровеносных сосудов и выход плазмы за
их пределы, что ведет к отеку окружающих тканей.
Дермонекротоксин вызывает некроз клеток в месте локализации
возбудителя.
16
Вышедший за пределы сосудов фибриноген плазмы, контактируя с
тромбокиназой некротизированных клеток макроорганизма, превращается в
фибрин, что и является сущностью дифтерического воспаления.
Корд-фактор – нарушает фосфорилирование процессов дыхания
эукариотических клеток.
Находясь внутри дифтерической плёнки, C. diphtheriae находят
отличную защиту от действия эффекторов иммунной системы и
антибиотиков. Размножаясь, они образуют в большом количестве основной
фактор патогенности – дифтерийный гистотоксин.
17
Дифтерийный гистотоксин. Возбудитель дифтерии продуцирует
мощный экзотоксин, который впервые получили Ру и Йерсен в 1888 г., что
явилось решающим моментом для установления этиологической роли
микроорганизма. Токсин проявляет все свойства экзотоксина -
термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный белок, нейтрализуемый
антитоксической сывороткой, имеет инкубационный период действия,
 – Corynebacterium diphtheriae
высаливается (NH4)SO4, адсорбируется на гидроокиси алюминия, теряет
активность при 40 С в течение недель при добавлении 0,4 % р-ра
формалина (т.е. переходит в анатоксин). Нативный токсин – полипептид с М
около 72 000 Д, состоящий из А-фрагмента (проявляет ферментативную
активность) и В-фрагмента (проявляет рецепторсвязывающие свойства).
Синтезируется в виде единой полипептидной цепи (протоксина), А- и
В-фрагменты которой в интактной молекуле соединены дисульфидными
мостиками. Протоксин активируется под действием протеолитических
ферментов и тиоловых соединений, что ведёт к образованию
бифункциональной А-В-структуры токсина.
Ограниченный протеолиз происходит под действием протеаз как
самого микроба, так и сопутствующей микрофлоры либо под действием
протеаз макроорганизма. Восстановление дисульфидных групп в
сульфгидрильные ведёт к завершению фрагментирования цепи, но
расхождение образовавшихся фрагментов А и В происходит только после
контакта с рецепторами чувствительной клетки. Т.о., рецепторы связывают
дифтерийный гистотоксин исключительно в интактном состоянии его
молекулы. Клетки всех чувствительных организмов способны рецептировать
В-фрагмент и поглощать молекулу посредством эндоцитоза, подобно многим
гормонам и вирусам.
Фрагмент В отвечает за специфическое взаимодействие со
специфическими ганглиозидными рецепторами клетки и участвует в
образовании транспортного канала для фрагмента А. В кислой среде эндосом
(фаголизосом) дисульфидные связи, объединяющие оба компонента,
разрушаются; фрагмент В взаимодействует с мембраной эндосомы, облегчая
19 проникновение фрагмента А в цитоплазму.
Активированный фрагмент А отвечает за токсичность. Компонент А
устойчив к денатурации и длительно сохраняется в цитозоле. Попав в
цитозоль эукариотической клетки, он становится недосягаемым для действия
антитоксических антител, которые через мембрану клетки не проникают.
Внутри пораженных клеток фрагмент А обладает ферментативной
активностью. Он относится к АДФ-рибозил-трансферазам, переносящим
АДФ-рибозу, отщепляемую от НАД+ с одновременным освобождением
никотинамида, на акцепторные белки-мишени.
20
Подобным свойством обладают многие токсины, но лишь
дифтерийный гистотоксин и токсин А Pseudomonas aeruginosa имеют
специфичную мишень – фактор элонгации 2 (ФЭ-2, EF-2 ,трансфераза 2) –
 – Corynebacterium diphtheriae
трансферазу, ответственную за наращивание (элонгацию) полипептидной
цепи на рибосоме.
Дифтерийный гистотоксин вызывает АДФ-рибозилирование фактора
элонгации EF-2 (трансферазы 2), необходимого для построения пептидных
цепей на рибосомах эукариотической клетки. Блокада функциональной
активности фермента ведёт к нарушению синтеза белка на стадии
элонгации и гибели клеток в результате некроза.
Прокариотические клетки нечувствительны к действию дифтерийного
гистотоксина, т.к. используют другой фактор элонгации (EF-6). Но эта
специфичность действия дифтерийного гистотоксина относительна, т.к. он
может проникать в клетки не только через поровый канал, а также путем
рецепторного эндоцитоза, но и путем пиноцитоза, активируясь внутри
клетки. При высоких концентрациях все 3 механизма его проникновения в
клетку имеют место, поэтому он может поражать любые клетки.
Дифтерийный гистотоксин оказывает свое специфическое
блокирующее воздействие на синтез белка в органах, наиболее интенсивно
снабженных кровью: ССС, миокард, периферическая и ЦНС, почки и
21
надпочечники.
C. diphtheriae не однородны по токсигенным свойствам и делятся на
токсигенные и нетоксигенные штаммы. Признак токсигенности для данного
вида не является обязательным. Заболевание вызывают только
токсигенные штаммы C. diphtheriae.
При этом не все биовары возбудителя образуют токсин, идентичный по
своим антигенным свойствам и механизму действия. Способность к
токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы C. diphtheriae,
содержащие умеренный профаг в своем геноме (β-фаг), несущий tox-ген,
ответственный за синтез токсина. Нетоксигенные штаммы не вызывают
дифтерии, хотя способны длительно персистировать в респираторном тракте
человека.
Из лабораторных животных к дифтерийному гистотоксину
чувствительны м.св., кролики, обезьяны, а также собаки, кошки, цыплята и
голуби. Экспериментальных моделей, на которых можно воспроизвести не
только токсикоз, но и дифтерийную инфекцию со всеми стадиями
инфекционного процесса, не существует, Определение токсигенности C. diph-
theriae проводят также на куриных эмбрионах и культурах клеток.
Наиболее восприимчивы к дифтерии дети от года до четырех лет.
 – Corynebacterium diphtheriae
Патогенез поражений. Входные ворота – слизистые оболочки
носоглотки, иногда глаз, половых органов (у женщин), кожные покровы и
раны. Начальным этапом инфекционного процесса является адгезия микроба
в месте входных ворот инфекции за счет поверхностных структур
бактериальной клетки (корд-фактор и коринеформные миколовые кислоты) и
их колонизация. Сам возбудитель остается на месте входных ворот
инфекции, а патогенез и клиническая картина определены действием
экзотоксина, который оказывает общее и местное действие.
Размножаясь в месте входных ворот инфекции, C. diphtheriae образует
дифтерийный гистотоксин, который оказывает местное воздействие на
клетки тканей, а также поступает в кровь, что ведет к возникновению
токсинемии. При наличии антитоксического иммунитета процесс может
ограничиться легкой формой заболевания или формированием
бактерионосительства.
Патоморфологическим проявлением взаимодействия макро- и
микроорганизма при дифтерии является фибринозное воспаление. В области
входных ворот инфекции развивается местное фибринозное воспаление,
сопровождающееся некрозом эпителиальных клеток, отеком и выходом
фибриногена из сосудистого русла в окружающие ткани и превращением его
в фибрин под действием тромбокиназы, освободившейся при некрозе
эпителиальных клеток. Это ведет к образованию налётов белого цвета с
сероватым или желтоватым оттенком, содержащих большое количество
22 микробов, продуцирующих токсин.
Фибринозная плёнка – характерный признак дифтерии. Характер
местного фибринозного воспаления обусловливает природа слизистых
оболочек. Фибринозное воспаление при дифтерии м.б. дифтерическим или
крупозным.
Дифтерическое воспаление возникает на слизистых оболочках с
многослойным плоским эпителием (ротоглотка, надгортанник, голосовые
связки, некоторые отделы полости носа), все клетки которого прочно связаны
как между собой, так и с подлежащей соединительнотканной основой. В этом
случае фибринозная плёнка плотно спаяна с подлежащей тканью и не
снимается тампоном при осмотре. При попытке сделать это слизистая
23 кровоточит.
При дифтерии ротоглотки, помимо изменения нёбных миндалин,
отмечается отек окружающих мягких тканей и увеличение региональных
лимфоузлов. Патологический процесс может распространяться как в

24
 – Corynebacterium diphtheriae
вышележащие отделы, поражая слизистую носа и среднего уха, так и в
нижележащие отделы.
Крупозное воспаление возникает при локализации патологического
процесса в дыхательных путях (гортань, трахея, бронхи), где слизистые
оболочки содержат железы, выделяющие слизь и покрытые однослойным
цилиндрическим эпителием. Здесь фибринозная пленка располагается
поверхностно и легко отделяется от подлежащих тканей. Процесс
сопровождают региональные лимфадениты.
В связи с легкостью отторжения поврежденных тканей, содержащих
микробы, токсических форм дифтерии при крупозном воспалении не
возникает. Такие больные часто откашливают целые слепки из различных
отделов дыхательных путей.
При разрастании плёнок, распространении процесса из ротоглотки вниз
по дыхательным путям в виде нисходящего крупа (от шотл. – карканье)
крупозное воспаление последовательно захватывает трахею и бронхиальное
дерево до его мельчайших разветвлений, что ведет к развитию истинного
крупа и асфиксии.
Системные проявления и симптомы специфической интоксикации,
возникновение осложнений обусловлены действием дифтерийного
гистотоксина, поражающего различные органы и системы. Поражение
периферической нервной системы обусловливает парезы и параличи мышц
мягкого нёба, глотки, языка; нарушения мимики и аккомодации, поражения
мышц шеи, туловища, конечностей, диафрагмы, дыхательных мышц. В
периферической нервной системе при дифтерии ротоглотки прежде всего
поражаются те нервы и вегетативные ганглии, которые ближе располагаются
к зеву.
Особенно характерны поражения миокарда и проводящей системы
сердца с возможным развитием миокардита, паралича сердечной мышцы или
её диффузного склероза. В адреналовой системе выявляют кровоизлияния
вплоть до некроза, в почках – явления токсического гломерулонефрита,
нефроза, некроза.
Ферменты C. diphtheriae (гиалуронидаза, нейраминидаза,
фибринолизин) обеспечивают проникновение возбудителя в различные
ткани, включая кровоток. Однако (в отличие от токсинемии) бактериемия
25
клинически не проявляется. Определенный вклад в патогенез поражений
вносит также корд-фактор (димиколат трегалозы), нарушающий
фосфорилирование и дыхательные процессы в различных клетках организма.
 – Corynebacterium diphtheriae
Клинические проявления. Инкубационный период – 2-12 сут. В
клинической картине дифтерии выделяют сменяющие друг друга периоды:
период манифестных проявлений фибринозного процесса и
ранних токсических поражений (первые 5-10 сут);
период поздних токсических осложнений (не обязательный, с
10-12 сут до 6 недели);
период реконвалесценции (2-3 мес после исчезновения
проявлений).
В зависимости от локализации процесса выделяют поражения:
ротоглотки (наиболее часто);
дыхательных путей;
носа;
редкой локализации (глаза, наружные половые органы, кожа, раневые
поверхности).
Совокупность клинических проявлений обусловливает следующие
синдромы.
 Синдром интоксикации включает непродолжительную
субфебрильную или фебрильную лихорадку, астеновегетативные проявления
(слабость, головные боли, потерю аппетита, рвоту, артериальную
гипертензию). Выраженность синдрома определяют клиническая форма и
локализация очага поражения (от единичных симптомов до выраженных
гемодинамических и тромбогеморрагических расстройств при токсических
формах).
 Синдром местного фибринозного воспаления определяет тип
поражаемого эпителия в месте входных ворот: на многослойном плоском
развивается дифтерическое воспаление, на однослойном цилиндрическом -
крупозное.
В ротоглотке выявляют фибринозное воспаление с образованием
плёнок (при снятии последних обнажается эрозированная поверхность). С
нарастанием тяжести заболевания распространенность пленок и
выраженность отека увеличиваются. Ведущий синдром – общетоксический.
В гортани выявляют (при ларингоскопии) фибринозные пленки на
слизистой оболочке и голосовых связках (крупозное воспаление),
отделяющиеся при кашле. Характерны грубый, лающий кашель и дисфония.
Отёк тканей и спазм мускулатуры обусловливают сужение дыхательных
путей и развитие синдрома крупа (обструкции дыхательных путей).
Возможно вовлечение трахеи и бронхов.
 – Corynebacterium diphtheriae
При дифтерии половых органов и кожи – серозно-сукровичное
отделяемое, незначительное образование пленок, при токсических формах –
отёки подкожной клетчатки.
При одновременном поражении двух и более органов диагностируется
комбинированная форма дифтерии. Клинические формы дифтерии
разнообразны – от локализованных до распространенных токсических форм
и дифтерийного крупа.
Наиболее тяжело протекает гипертоксическая форма дифтерии,
которая может привести к смерти в течение первых суток.
В благоприятных случаях заболевание заканчивается полным
выздоровлением.
26
Иммунитет. После перенесенного заболевания формируется
длительный и напряженный гуморальный антитоксический иммунитет.
Особое значение имеет образование антител к фрагменту В. Они
нейтрализуют дифтерийный гистотоксин, предупреждая прикрепление
последнего к клетке.
Благодаря пластичности поверхностных структур C. diphtheriae и их
местному воздействию, антибактериальный иммунитет ненапряженный,
серовароспецифичный, в большой степени носит клеточно-опосредованный
характер. Наличие же антитоксического иммунитета не препятствует
формированию носительства токсигенных штаммов C. diphtheriae.
Специфическое лечение дифтерии.
27
Дифтерия – это токсинемическая инфекция. Поэтому, исходя из
патогенеза заболевания, в целях нейтрализации дифтерийного гистотоксина
на первый план в лечении выходит применение специфической
противодифтерийной лошадиной очищенной концентрированной
жидкой сыворотки (дифтерийный антитоксин). Препарат получают путем
гипериммунизации лошадей дифтерийным анатоксином. Действующим
началом препарата является дифтерийный антитоксин. Серотерапия
эффективна в ранний перод болезни, пока токсин не фиксирован клетками
организма и ткани существенно не повреждены.
Специфическое лечение противодифтерийной сывороткой
(антитоксином) начинают немедленно при клиническом подозрении на
дифтерию. Надо стремиться к оптимальному режиму её введения, т.к.
антитоксин может нейтрализовать только циркулирующий в крови и лимфе
токсин, который еще не связан с тканями. Отсюда следует, что
 – Corynebacterium diphtheriae
бактериологическая диагностика является важным, но запоздалым
подтверждением дифтерии.
Антитоксическая противодифтерийная сыворотка вводится в дозах 10-
50 тыс. АЕ – в зависимости от возраста и тяжести заболевания. 1 АЕ – это
такое минимальное количество сыворотки, которое нейтрализует 100 DLM
дифтерийного токсина.
В целях профилактики анафилактического шока препарат вводят
дробно по А.М. Безредке. Введение сыворотки после 3-го дня болезни
считается поздним. Разработан также иммуноглобулин человека
противодифтерийный для внутривенного введения.
Поскольку введение антитоксина не оказывает влияния на
размножение возбудителя в месте входных ворот инфекции, одновременно с
введением антитоксической противодифтерийной сыворотки, больным
необходимо обязательно назначать антибиотики, оказывающие действие
на эти бактерии. Препаратами выбора являются пенициллин или
эритромицин либо другие β-лактамы и макролиды. При лечении
бактерионосителей необходимо проводить стимуляцию
антибактериального иммунитета. Симптоматическое лечение:
детоксикационная инфузионная терапия, восстановление проходимости
дыхательных путей при асфиксии, кардиотропные препараты и т.д.
Возможны повторные случаи возникновения дифтерии, т.к.
применение антитоксической сыворотки и антибиотиков уменьшает
интенсивность антигенного воздействия на иммунную систему, что ведет
к формированию непродолжительного и ненапряженного иммунитета. В
связи с этим в целях коррекции иммунного ответа больные дифтерией
должны вакцинироваться до выписки из стационара.
Выписку больных производят только после двукратного
отрицательного результата бактериологического исследования.

Специфическая профилактика дифтерии

Активная. Вакцинация для создания искусственного активного

антитоксического иммунитета осуществляется дифтерийным анатоксином.
Очищенный и концентрированный препарат входит в состав
ассоциированных вакцин:
АКДС-вакцина – адсорбированная коклюшно-дифтерийно-
столбнячная вакцина;
 – Corynebacterium diphtheriae
АДС-анатоксин – адсорбированный дифтерийно-столбнячный
анатоксин;
АДС-М-анатоксин – адсорбированный дифтерийно-
столбнячный анатоксин с уменьшенным содержанием антигенов (АДС-М-
анатоксин);
АД-М-анатоксин – адсорбированный дифтерийный анатоксин с
уменьшенным содержанием антигена.
Базисный иммунитет создаётся у детей согласно календарю прививок
полноценными в антигенном отношении препаратами. Препараты с
уменьшенным содержанием антигена менее реактогенны и применяются
только у детей старше 6 лет, подростков и взрослых.
Дифтерия относится к контролируемым инфекциям, но только 95 %-й
охват населения прививками гарантирует эффективность вакцинации. Если у
привитых лиц и возникает заболевание, то, как правило, протекает легко.
В любом очаге дифтерии необходимо проводить экстренный
иммунологический контроль состояния иммунитета, и выявленные,
восприимчивые к этой инфекции лица должны быть незамедлительно
привиты (защитный титр в РНГА 1:40 и выше) – ревакцинированы.
Наличие и содержание АТ к дифтерийному токсину можно также определять
в РПГА с дифтерийным анатоксическим эритроцитарным диагностикумом;
РНАТ; с помощью кожной реакции (пробы) Шика, включающей
внутрикожное введение 1/40 Dlm токсина в 0,2 мл (в настоящее время не
применяют).

В России зарегистрированы также следующие вакцины:

тетракок, предназначенная для профилактики коклюша, дифтерии,
столбняка и полиомиелита (Пастер-Мерье, Франция). Она более реактогенная, чем АКДС;
Д.Т. Вакс, содержащая дифтерийный и столбнячный анатоксины.
Применяется у детей до 6 лет;
ДТ-адюльт, содержащая дифтерийный и столбнячный анатоксины (Пастер-
Мерье, Франция). Применяется у подростков и взрослых.
В настоящее время в России разработаны и предложены новые вакцины для
одновременной иммунизации против дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В: АКДС-
В-гепатитная вакцина («Бубо-Кок») и АДС-М-В-гепатитная вакцина («Бубо-М»).
Последняя состоит из поверхностного антигена вируса гепатита В (HbsAg), полученного с
помощью рекомбинантной технологии из культуры дрожжевых клеток, а также
очищенных и адсорбированных на гидроксиде алюминия дифтерийного и столбнячного
анатоксинов в уменьшенной концентрации, аналогичной их концентрации в АДС-М.
Данный препарат зарегистрирован в установленном порядке и разрешен к
промышленному выпуску и медицинскому применению.
 – Corynebacterium diphtheriae

Пассивная специфическая профилактика дифтерии

Проводится в очагах заболевания антитоксической сывороткой, доза
которой определяется формой и тяжестью заболеваний.

28 Лабораторная диагностика дифтерии.

Ввиду полиморфизма возбудителя (от мелких до крупных,
сегментированных и бочкообразных форм), бактериоскопический метод
диагностики дифтерии как самостоятельный диагностический метод не
применяется, но м.б. проведён по просьбе врача.
Окраска по Граму неспецифична, но позволяет косвенно
идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде
палисада (параллельно) или китайских иероглифов. Окраска по Найссеру
выявляет характерные зёрна волютина (Бабеша-Эрнста) и позволяет
отдифференцировать C. diphtheriae от Corynebacterium pseudodiphtheriticum (C.
hofmanni), однако к результатам следует относиться с осторожностью, т.к. в
мазках могут присутствовать и другие зернистые бактерии (напр.,
стрептобациллы).
При наличии выраженной клиники в текущих исследованиях обычно
ограничиваются бактериоскопией мазков и обнаружением микроорганизмов,
аналогичных по морфологии и тинкториальным свойствам C. diphtheriae, чего
вполне достаточно для подтверждения клинического диагноза.
Основным является бактериологический метод диагностики. Цель
данного метода заключается в выделении чистой культуры C. diphtheriae и
идентификации их на основании морфологических, культуральных,
биохимических и токсигенных свойств. При наличии клинических
симптомов заболевания выделение токсигенных штаммов C. diphtheriae
является абсолютным подтверждением диагноза дифтерии, а при их
отсутствии – свидетельствует о бактерионосительстве. Бактериологическому
обследованию в обязательном порядке подвергаются все больные ангинами,
а также больные с подозрением на дифтерию.
Материалом для исследования служат слизь и плёнки из очагов
воспаления, а также секрет из очагов патологического процесса. Сбор
материала необходимо осуществлять в течение 3-4 ч (не более 12) с момента
обращения больного. Для взятия материала используют сухие ватные
тампоны, если посев будет произведен не позднее 2-3 ч после сбора
материала. При необходимости транспортировки материала на дальние
 – Corynebacterium diphtheriae
расстояния используют тампоны, смоченные 5 % р-ром глицерина. Забор
материала (и посев) делают раздельными парными (на бактериологию + на
мазок) тампонами из разных мест локализации воспаления.
Бактериологическая лаборатория через 48 ч выдаёт ответ об
отсутствии в анализах C. diphtheriae, или, в случае наличия положительных
результатов исследования на токсигенность (не более 6 колоний) и пробы на
цистиназу, о выделении токсигенных штаммов C. diphtheriae.
Различают 3 вида показаний к проведению бактериологического
исследования на дифтерию:
диагностическое обследование детей и взрослых с острыми
воспалительными явлениями в носоглотке, особенно при подозрении на
дифтерию;
по эпидемическим показаниям обследуют детей и взрослых,
бывших в контакте с источником инфекции;
с профилактической целью обследуют лиц, вновь поступающих в
детские дома, школы-интернаты, специальные учреждения (исключение
носительства).
Бактерии выделяют посевом на элективные теллуритовые среды
(Клауберга II или Маклеода). ВОЗ (1993) рекомендует также производить
посев на кровяной агар, т.к. не все штаммы возбудителя хорошо растут на
средах с теллуритом. Следует помнить, что восстанавливать теллур и
образовывать тёмные колонии способны многие кокки и дрожжи.
Ложнодифтерийная палочка (палочка Хофманна - C. hofmanni) теллур не
восстанавливает.
Для выделения чистой культуры часть подозрительной колонии (с
элективной среды) засевают на скошенный агар или среду Ру, вторую часть –
на плотную ПС для определения токсигенности и, не обжигая петли,
29
проводят постановку пробы Пизу. При положительном результате
наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола.
Чистую культуру идентифицируют на средах Гисса (Хисса), пользуясь
коротким рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина). Это позволяет
отдифференцировать C. diphtheriae от непатогенных коринебактерий либо
использовать длинный ряд (включающий дополнительно крахмал и
гликоген) для идентификации биоваров.
Дополнительным методом дифференцировки палочек Клебса-Лёффлера (C. diph-
theriae) и Хофманна (ложнодифтерийная палочка) считается изучение способности
расщеплять мочевину: Corynebacterium pseudodiphtheriticum (C. hofmanni) инертна к
углеводам короткого ряда, но ферментирует мочевину.
 – Corynebacterium diphtheriae
Для полной идентификации исследуют способность расти в
анаэробных условиях посевом уколом в столбик 0,5 % сахарного агара
(растёт только C. diphtheriae).
Определение токсигенности
1. Токсигенность in vivo проводят п/к или внутрикожным заражением
бульонной культурой (0,5-1,0 мл) м.св. массой 250 г. Сила токсина
измеряется в DLM. 1 DLM – это минимальное количество токсина, которое
при подкожном введении морской свинке массой 250 г вызывает ее гибель на
4-5 сут при характерной патологоанатомической картине: надпочечники
увеличены, резко гиперемированы, в полостях геморрагический экссудат.
2. С учетом высокой стоимости и недоступности широкого применения
биопробы при определении вирулентности (токсигенности) возбудителя
были предложены различные методы оценки токсигенности in vitro:
На плотных ПС (Кинг, Парсонс, Фробишер и др.).
Тест Илека и Оухтерлони (1948) получил широкое распространение. Его
достоинства – простота, доступность, точность и экспрессность (ч/з 24 ч)
получения результатов. Основу теста составляет способность токсина и
антитоксина диффундировать в агар и образовывать преципитаты (усы
или стрелы) по ходу диффузии. Контрольные штаммы заказывают в
ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора. Определение токсигенных
свойств проводится бактериологами в первые сутки роста подозрительных
колоний на чашках первичного посева материала. Во избежание ошибок
30 при определении токсигенных свойств коринебактерий, необходимо
изучать данный признак у максимального числа выросших колоний с
чашек первичного посева. Можно изучить токсигенность более чем у 20
подозрительных колоний из одного анализа. Нельзя изучать материал при
множественном росте подозрительных колоний только в одной-двух
бляшках.
Серология. Для ускоренного обнаружения дифтерийного гистотоксина,
как в бактериальных культурах, так и в биологических жидкостях
(сыворотка крови), применяют:
РА на стекле – положительная только в 32,4 % случаев заболевания;
РПГА – более чувствительная, положительная у 84,4 % больных. У 70
% больных в начале заболевания РПГА отрицательна или
положительна в разведении 1:40-1:80, в последующем титры нарастают
в 8-4000 раз;
РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом;
РНА (реакция нейтрализации антител) – о наличии токсина судят по
эффекту предотвращения гемагглютинации;
 – Corynebacterium diphtheriae
РИА и ИФА.
Молекулярно-генетические методы – ПЦР. На практике применяют
праймеры для фрагмента А, амплифицирующие фрагменты гена,
полученные кипячением культуры (как чистой, так и смешанной) в
течение 15 мин.
31

Благодарю за внимание.