Лабораторная работа № 6

Тема: Рецепторная функция мембран. Схема принятия и

ответа клетки на сигнал.

Важное свойство мембран - способность воспринимать и передавать внутрь клетки сигналы из

окружающей среды. Восприятие клетками внешних сигналов происходит при их взаимодействии с
рецепторами, расположенными в мембране клеток-мишеней. Рецепторы, присоединяя сигнальную
молекулу, активируют внутриклеточные пути передачи информации, это приводит к изменению
скорости различных метаболических процессов.

1. Сигнальная молекула, специфически взаимодействующая с мембранным рецептором,

называется первичным мессенджером. В качестве первичных мессенджеров выступают
различные химические соединения - гормоны, нейромедиаторы, эйкозаноиды, ростовые факторы
или физические факторы, например квант света. Рецепторы клеточной мембраны, активированные
первичными мессенджерами, передают полученную информацию системе белков и ферментов,
которые образуют каскад передачи сигнала, обеспечивающий усиление сигнала в несколько сот
раз. Время ответа клетки, заключающееся в активации или инактивации метаболических процессов,
мышечного сокращения, транспорта веществ из клеток-мишеней, может составлять несколько
минут.

Мембранные рецепторы подразделяются на:

• рецепторы, содержащие субъединицу, связывающую первичный мессенджер, и ионный канал;

• рецепторы, способные проявлять каталитическую активность;

• рецепторы, с помощью G-белков активирующие образование вторичных (внутриклеточных)

мессенджеров, передающих сигнал специфическим белкам и ферментам цитозоля (рис. 4.10).

Вторичные мессенджеры имеют небольшую молекулярную массу, с высокой скоростью

диффундируют в цитозоле клетки, изменяют активность соответствующих белков, а затем быстро
расщепляются или удаляются из цитозоля.

Рис. 4.10. Рецепторы,

локализованные в мембране.

Мембранные рецепторы можно разделить на три группы. Рецепторы: 1 - содержащие субъединицу,

связывающую сигнальную молекулу и ионный канал, например рецептор ацетилхолина на
постсинаптической мембране; 2 - проявляющие каталитическую активность после присоединения
сигнальной молекулы, например рецептор инсулина; 3, 4 - передающие сигнал на фермент
аденилатциклазу (АЦ) или фосфолипазу С (ФЛС) при участии мембранных G-белков, например
разные типы рецепторов адреналина, ацетилхолина и других сигнальных молекул
Роль вторичных мессенджеров выполняют молекулы и ионы:

• цАМФ (циклический аденозин-3',5'-монофосфат);

• цГМФ (циклический гуанозин-3',5'-монофосфат);

• ИФ3 (инозитол-1,4,5-трифосфат);

• ДАГ (диацилглицерол);

• Са2+.

Существуют гормоны (стероидные и тиреоидные), которые, проходя липидный бислой, проникают

в клетку и взаимодействуют с внутриклеточными рецепторами. Физиологически важным
различием между мембранными и внутриклеточными рецепторами является скорость ответа на
поступающий сигнал. В первом случае эффект будет быстрым и непродолжительным, во втором -
медленным, но длительным.

Рецепторы, сопряженные с G-белками

Взаимодействие гормонов с рецепторами, сопряженными с G-белками, приводит к активации

инозитолфосфатной системы трансдукции сигнала или изменению активности аденилатциклазной
регуляторной системы.

2. Аденилатциклазная система включает (рис. 4.11):

- интегральные белки цитоплазматической мембраны:

• Rs - рецептор первичного мессенджера - активатора аденилатциклазной системы (АЦС);

• R; - рецептор первичного мессенджера - ингибитора АЦС;

• фермент аденилатциклазу (АЦ).

- «заякоренные» белки:

• Gs - ГТФ-связывающий белок, состоящий из α,,βγ-субъединиц, в котором (α,-субъединица связана

с молекулой ГДФ;

Рис. 4.11. Функционирование аденилатциклазной системы

• G; - ГТФ-связывающий белок, состоящий из αβγ-субъединиц, в котором а;-субъединица связана с
молекулой ГДФ; - цитозольный фермент протеинкиназу А (ПКА).

Последовательность событий передачи сигнала первичных мессенджеров с помощью

аденилатциклазной системы

Рецептор имеет центры связывания первичного мессенджера на наружной поверхности мембраны и

G-белка (α,,βγ-ГДФ) на внутренней поверхности мембраны. Взаимодействие активатора
аденилатциклазной системы, например гормона с рецептором (Rs), приводит к изменению
конформации рецептора. Увеличивается сродство рецептора к G..-белку. Присоединение комплекса
гормон-рецептор к GS-ГДФ снижает сродство α,,-субъединицы G..-белка к ГДФ и увеличивает
сродство к ГТФ. В активном центре α,,-субъединицы ГДФ замещается на ГТФ. Это вызывает
изменение конформации субъединицы α,, и снижение ее сродства к субъединицам βγ.
Отделившаяся субъединица α,,-ГТФ латерально перемещается в липидном слое мембраны к
ферменту аденилатциклазе.

Взаимодействие α,,-ГТФ с регуляторным центром аденилатциклазы изменяет конформацию

фермента, приводит к его активации и увеличению скорости образования вторичного мессенджера -
циклического аденозин- 3',5'-монофосфата (цАМФ) из АТФ. В клетке повышается концентрация
цАМФ. Молекулы цАМФ могут обратимо соединяться с регуляторными субъединицами
протеинкиназы А (ПКА), которая состоит из двух регуляторных (R) и двух каталитических (С)
субъединиц - (R2С2). Комплекс R2С2 ферментативной активностью не обладает. Присоединение
цАМФ к регуляторным субъединицам вызывает изменение их конформации и потерю
комплементарности к С-субъединицам. Каталитические субъединицы приобретают ферментативную
активность.

Активная протеинкиназа А с помощью АТФ фосфорилирует специфические белки по остаткам

серина и треонина. Фосфорилирование белков и ферментов повышает или понижает их активность,
поэтому изменяется скорость метаболических процессов, в которых они участвуют.

Активация сигнальной молекулой рецептора R стимулирует функционирование Gj-белка, которое

протекает по тем же правилам, что и для G..-белка. Но при взаимодействии субъединицы α i-ГТФ с
аденилатциклазой активность фермента снижается.

Инактивация аденилатциклазы и протеинкиназы А

α,,-Субъединица в комплексе с ГТФ при взаимодействии с аденилатциклазой начинает проявлять

ферментативную (ГТФ-фосфатазную) активность, она гидролизует ГТФ. Образующаяся молекула
ГДФ остается в активном центре α,,-субъединицы, изменяет ее конформацию и уменьшает сродство
к АЦ. Комплекс АЦ и α,,-ГДФ диссоциирует, α,,-ГДФ включается в G..-белок. Отделение α,,-ГДФ от
аденилатциклазы инактивирует фермент и синтез цАМФ прекращается.

Фосфодиэстераза - «заякоренный» фермент цитоплазматической мембраны гидролизует

образовавшиеся ранее молекулы цАМФ до АМФ. Снижение концентрации цАМФ в клетке вызывает
расщепление комплекса цАМФ4К"2 и повышает сродство R- и С-субъединиц, образуется неактивная
форма ПКА.

Фосфорилированные ферменты и белки под действием фосфопротеинфосфатазы переходят в

дефосфорилированную форму, изменяется их конформация, активность и скорость процессов, в
которых участвуют эти ферменты. В результате система приходит в исходное состояние и готова
вновь активироваться при взаимодействии гормона с рецептором. Таким образом, обеспечивается
соответствие содержания гормона в крови и интенсивности ответа клеток-мишеней.

3. Участие аденилатциклазной системы в регуляции экспрессии генов. Многие белковые

гормоны: глюкагон, вазопрессин, паратгормон и др., передающие свой сигнал посредством
аденилатциклазной системы, могут не только вызвать изменение скорости реакций путем
фосфорилирования уже имеющихся в клетке ферментов, но и увеличивать или уменьшать их
количество, регулируя экспрессию генов (рис. 4.12). Активная протеинкиназа А может проходить в
ядро и фосфорилировать фактор транскрипции (СRЕВ). Присоединение фосфорного

Рис. 4.12.
Аденилатциклазный путь, приводящий к экспрессии специфических генов

остатка повышает сродство фактора транскрипции (СRЕВ-(Р) к специфиче-ской последовательности

регуляторной зоны ДНК-СRЕ (цАМФ-response element) и стимулирует экспрессию генов
определенных белков.

Синтезированные белки могут быть ферментами, увеличение количества которых повышает

скорость реакций метаболических процессов, или мембранными переносчиками, обеспечивающими
поступление или выход из клетки определенных ионов, воды или других веществ.
 Рис. 4.13. Инозитолфосфатная система

Работу системы обеспечивают белки: кальмодулин, фермент протеинкиназа С, Са 2+-кальмодулин-

зависимые протеинкиназы, регулируемые Са2+-каналы мембраны эндоплазматического ретикулума,
Са2+-АТФазы клеточной и митохондриальной мембран.

Последовательность событий передачи сигнала первичных мессенджеров с помощью

инозитолфосфатной системы

Связывание активатора инозитолфосфатной системы с рецептором (R) приводит к изменению его

конформации. Повышается сродство рецептора к Gфлс-белку. Присоединение комплекса первичный
мессенджер-рецептор к Gфлс-ГДФ снижает сродство афлс-субъединицы к ГДФ и увеличивает
сродство к ГТФ. В активном центре афлс-субъединицы ГДФ замещается на ГТФ. Это вызывает
изменение конформации субъединицы афлс и снижение сродства к субъединицам βγ, происходит
диссоциация Gфлс-белка. Отделившаяся субъединица афлс-ГТФ латерально перемещается по
мембране к ферменту фосфолипазе С.

Взаимодействие афлс-ГТФ с центром связывания фосфолипазы С изменяет конформацию и

активность фермента, возрастает скорость гидролиза фосфолипида клеточной мембраны -
фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфа- та (ФИФ2) (рис. 4.14).

Р ис. 4.14. Гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-

бисфосфата (ФИФ2)
В ходе реакции образуются два продукта - вторичные вестники гормонального сигнала (вторичные
мессенджеры): диацилглицерол, который остается в мембране и участвует в активации фермента
протеинкиназы С, и инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3), который, будучи гидрофильным соединением,
уходит в цитозоль. Таким образом, сигнал, принятый рецептором клетки, раздваивается.
ИФ3 связывается специфическими центрами Са2+- канала мембраны эндоплазматического
ретикулума (Э)), что приводит к изменению конформации белка и открытию Са 2+-канала. Так как
концентрация кальция в ЭР примерно на 3-4 порядка выше, чем в цитозоле, после открытия канала
Са2+ по градиенту концентрации поступает в цитозоль. В отсутствие ИФ3 в цитозоле канал закрыт.

В цитозоле всех клеток содержится небольшой белок кальмодулин, имеющий четыре центра
связывания Са2+. При повышении концентрации

кальция он активно присоединяется к кальмодулину, образуя комплекс 4Са 2+-кальмодулин. Этот

комплекс взаимодействует с Са2+-кальмодулинзависимыми протеинкиназами, другими ферментами
и повышает их активность. Активированная Са2+-кальмодулин-зависимая протеинкиназа
фосфорилирует определенные белки и ферменты, в результате чего изменяется их активность и
скорость метаболических процессов, в которых они участвуют.

Повышение концентрации Са2+ в цитозоле клетки увеличивает скорость взаимодействия Са2+ с

неактивным цитозольным ферментом протеинкиназой С (ПКС). Связывание ПКС с ионами кальция
стимулирует перемещение белка к плазматической мембране и позволяет ферменту вступать во
взаимодействие с отрицательно заряженными «головками» молекул фосфатидилсерина (ФС)
мембраны. Диацилглицерол, занимая специфические центры в протеинкиназе С, в еще большей
степени увеличивает ее сродство к ионам кальция. На внутренней стороне мембраны образуется
активная форма ПКС (ПКС ? Са2+ ? ФС ? ДАГ), которая фосфорилирует специфические ферменты.

Включение ИФ-системы непродолжительно, и после ответа клетки на стимул происходит

инактивация фосфолипазы С, протеинкиназы С и Са2+-кальмодулин-зависимых ферментов. афлс-
Субъединица в комплексе с ГТФ и фосфолипазой С проявляет ферментативную (ГТФ-
фосфатазную) активность, она гидролизует ГТФ. Связанная с ГДФ афлс-субъединица теряет
сродство к фосфолипазе С и возвращается в исходное неактивное состояние, т.е. включается в
комплекс αβγ-ГДФ Gфлс-белок).

Отделение афлс-ГДФ от фосфолипазы С инактивирует фермент и гидролиз ФИФ2 прекращается.

Повышение концентрации Са2+ в цитозоле активирует работу Са2+-АТФаз эндоплазматического
ретикулума, цитоплазматической мембраны, которые «выкачивают» Са2+ из цитозоля клетки. В этом
процессе принимают участие также Na+/Са2+- и Н+/Са2+-переносчики, функционирующие по
принципу активного антипорта. Снижение концентрации Са2+ приводит к диссоциации и инактивации
Са2+-кальмодулинзависимых ферментов, а также потере сродства протеинкиназы С к липидам
мембраны и снижению ее активности.

ИФ3 и ДАГ, образовавшиеся в результате активации системы, могут снова взаимодействовать друг с
другом и превращаться в фосфатидилинозитол- 4,5-бисфосфат.

Фосфорилированные ферменты и белки под действием фосфопротеинфосфатазы переходят в

дефосфорилированную форму, изменяется их конформация и активность.

5. Каталитические рецепторы. Каталитические рецепторы являются ферментами. Активаторами

этих ферментов могут быть гормоны, ростовые факторы, цитокины. В активной форме - рецепторы-
ферменты фосфорилируют специфические белки по -ОН-группам тирозина, поэтому их называют
тирозиновыми протеинкиназами (рис. 4.15). При участии специальных механизмов сигнал,
полученный каталитическим рецептором, может быть передан в ядро, где он стимулирует или

подавляет экспрессию определенных генов.

Рис. 4.15. Активация рецептора инсулина.

Фосфопротеинфосфатаза дефосфорилирует специфические фосфопротеины.

Фосфодиэстераза превращает цАМФ в АМФ и цГМФ в ГМФ.

ГЛЮТ 4 - переносчики глюкозы в инсулинзависимых тканях.

Тирозиновая протеинфосфатаза дефосфорилирует β-субъединицы рецептора

инсулина

Примером каталитического рецептора может служить рецептор инсулина, в состав которого входят
две а- и две β-субъединицы. а-Субъединицы расположены на наружной поверхности клеточной
мембраны, β-субъединицы пронизывают мембранный бислой. Центр связывания инсулина
образован N-концевыми доменами а-субъединиц. Каталитический центр рецептора находится на
внутриклеточных доменах β-субъединиц. Цитозольная часть рецептора имеет несколько остатков
тирозина, которые могут фосфорилироваться и дефосфорилироваться.

Присоединение инсулина в центр связывания, образованный а-субъединицами, вызывает

кооперативные конформационные изменения рецептора. β-Субъединицы проявляют
тирозинкиназную активность и катализируют трансаутофосфорилирование (первая β-субъединица
фосфорилирует вторую β-субъединицу, и наоборот) по нескольким остаткам тирозина.
Фосфорилирование приводит к изменению заряда, конформации и субстратной специфичности
фермента (Тир-ПК). Тирозиновая-ПК фосфорилирует определенные клеточные белки, которые
получили название субстратов рецептора инсулина. В свою очередь эти белки участвуют в
активации каскада реакций фосфорилирования:

• фосфопротеинфосфатазы (ФПФ), которая дефосфорилирует специфические фосфопротеины;

• фосфодиэстеразы, которая превращает цАМФ в АМФ и цГМФ в ГМФ;

• ГЛЮТ 4 - переносчиков глюкозы в инсулинзависимых тканях, поэтому повышается поступление

глюкозы в клетки мышц и жировой ткани;

• тирозиновой протеинфосфатазы, которая дефосфорилирует β-субъединицы рецептора

инсулина;
• регуляторных белков ядра, факторов транскрипции, повышающих или снижающих экспрессию
генов определенных ферментов.

Реализация эффекта ростовых факторов может осуществляться с помощью каталитических

рецепторов, которые состоят из одной полипептидной цепи, но при связывании первичного
мессенджера образуют димеры. Все рецепторы этого типа имеют внеклеточный гликозилированный
домен, трансмембранный (а-спираль) и цитоплазматический домен, способный при активации
проявлять протеинкиназную активность.

Димеризация способствует активации их каталитических внутриклеточных доменов, которые

осуществляют трансаутофосфорилирование по аминокислотным остаткам серина, треонина или
тирозина. Присоединение фосфорных остатков приводит к формированию у рецептора центров
связывания для специфических цитозольных белков и активации протеинкиназного каскада
передачи сигнала (рис. 4.16).

Последовательность событий передачи сигнала первичных мессенджеров (ростовых

факторов) при участии Ras- и Raf-белков.

Связывание рецептора (R) с фактором роста (ФР) приводит к его димеризации и

трансаутофосфорилированию. Фосфорилированный рецептор приобретает сродство к Grb2-белку.
Образованный комплекс ФР*R*Grb2 взаимодействует с цитозольным белком SOS. Изменение
конформации SOS

обеспечивает его взаимодействие с заякоренным белком мембраны Ras-ГДФ. Образование

комплекса ФР?R?Gгb2?SOS?Ras-ГДФ снижает сродство Ras- белка к ГДФ и увеличивает сродство к
ГТФ.

Замена ГДФ на ГТФ изменяет конформацию Ras-белка, который отделяется от комплекса и

взаимодействует с Raf-белком в примембранной области. Комплекс Ras-ГТФ?Raf проявляет
протеинкиназную активность и фосфорилирует фермент МЕК-киназу. Активированная МЕК-киназа в
свою очередь фосфорилирует МАП-киназу по треонину и тирозину.

Рецепторы такого типа имеют эпидермальный фактор роста (ЭФР), фактор роста нервов (ФРН) и
другие ростовые факторы.

Grb2 - протеин, взаимодействующий с рецептором ростового фактора ( growth receptor binding

protein); SOS (GEF) - ГДФ-ГТФ обменный фактор (guanine nucleotide exchange factor); Ras - G-белок
(гуанидинтрифосфатаза); Raf-киназа - в активной форме - фосфорилирующая МЕК-киназу; МЕК-
киназа - киназа МАП-киназы; МАП-киназа - митогенактивированная протеинкиназа (mitogen-aktivated
protein kinase)

Присоединение группы -РО32- к аминокислотным радикалам МАП-киназы изменяет ее заряд,

конформацию и активность. Фермент фосфорилирует по серину и треонину специфические белки
мембран, цитозоля и ядра.

Изменение активности этих белков оказывает влияние на скорость метаболических процессов,

функционирование мембранных транслоказ, митотическую активность клеток-мишеней.

Рецепторы с гуанилатциклазной активностью также относятся к каталитическим

рецепторам. Гуанилатциклаза катализирует образование из ГТФ цГМФ, который является одним из
важных мессенджеров (посредников) внутриклеточной передачи сигнала (рис. 4.17).
 Рис. 4.17. Регуляция активности мембранной
гуанилатциклазы.

Мембранно-связанная гуанилатциклаза (ГЦ) - трансмембранный гликопротеин. Центр связывания

сигнальной молекулы находится на внеклеточном домене, внутриклеточный домен гуанилатциклазы
в результате активации проявляет каталитическую активность

Присоединение первичного мессенджера к рецептору активирует гуанилатциклазу, которая

катализирует превращение ГТФ в циклический гуанозин-3',5'-монофосфат (цГМФ) - вторичный
мессенджер. В клетке повышается концентрация цГМФ. Молекулы цГМФ могут обратимо
присоединяться к регуляторным центрам протеинкиназы G (ПКЧ5), которая состоит из двух
субъединиц. Четыре молекулы цГМФ изменяют конформацию и активность фермента. Активная
протеинкиназа G катализирует фосфорилирование определенных белков и ферментов цитозоля
клетки. Одним из первичных мессенджеров протеинкиназы G является предсердный
натриуретический фактор (ПНФ), регулирующий гомеостаз жидкости в организме.

6. Передача сигнала с помощью внутриклеточных рецепторов. Гидрофобные по химической

природе гормоны (стероидные гормоны и тироксин) могут диффундировать через мембраны,
поэтому их рецепторы находятся в цитозоле или ядре клетки.

Цитозольные рецепторы связаны с белком-шапероном, который предотвращает преждевременную

активацию рецептора. Ядерные и цитозольные рецепторы стероидных и тиреоидных гормонов
содержат ДНКсвязывающий домен, обеспечивающий в ядре взаимодействие комплекса гормон-
рецептор с регуляторными участками ДНК и изменение скорости транскрипции.

Последовательность событий, приводящих к изменению скорости транскрипции

Гормон проходит через двойной липидный слой клеточной мембраны. В цитозоле или ядре гормон
взаимодействует с рецептором. Комплекс гормон-рецептор проходит в ядро и присоединяется к
регуляторной нуклеотидной последовательности ДНК - энхансеру (рис. 4.18)
или сайленсеру. Доступность промотора для РНК-полимеразы увеличивается при взаимодействии
с энхансером или уменьшается при взаимодействии с сайленсером. Соответственно увеличивается
или уменьшается скорость транскрипции определенных структурных генов. Зрелые мРНК выходят
из ядра. Увеличивается или уменьшается скорость трансляции определенных белков. Изменяется
количество белков, которые влияют на метаболизм и функциональное состояние клетки.

В каждой клетке существуют рецепторы, включенные в состав разных сигнал-трансдукторных

систем, преобразующих все внешние сигналы во внутриклеточные. Число рецепторов для
конкретного первичного мессенджера может варьировать в пределах от 500 до более 100 000 на
клетку. Они располагаются на мембране отдаленно друг от друга либо сосредоточены в
определенных ее участках.