Вы находитесь на странице: 1из 9

HOMOLOGOUS GENETIC ГОМОЛОГИЧНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ

RECOMBINATION
V. M. GLASER
РЕКОМБИНАЦИЯ
Ç. å. ÉãÄáÖê
Genetic recombination is åÓÒÍÓ‚ÒÍËÈ „ÓÒÛ‰‡ÒÚ‚ÂÌÌ˚È ÛÌË‚ÂÒËÚÂÚ
a major source of heredi- ËÏ. å.Ç. ãÓÏÓÌÓÒÓ‚‡
tary variation. This
defines its important role ÇÇÖÑÖçàÖ
in evolution as well as in Генетическая рекомбинация – это перераспре-
processes of ontogene- деление генетического материала (ДНК), приводя-
sis. In this article are щее к возникновению новых комбинаций генов.
Рекомбинация может происходить путем обмена
examined the nature and клеточными ядрами, целыми молекулами ДНК или
current models of homo- частями молекул. В то время как процессы реплика-
logous (general) recombi- ции и репарации ДНК1 обеспечивают воспроизведе-
ние и сохранение генетического материала, реком-
nation, i.e. the process, бинация приводит к генетической изменчивости.
when the interaction Биологическое значение рекомбинации столь вели-
(synapsis) between recom- ко, что она получила развитие у всех живых орга-
низмов. Она может происходить у эукариот (как
bining homologous mole- при образовании половых клеток – гамет, так и в со-
cules is based on mutual матических клетках), у бактерий и даже при размно-
recognition and pairing жении вирусов, в том числе таких, генетический ма-
териал которых состоит из РНК. Перетасовка
of DNA complementary хромосом в мейозе, приводящая к огромному раз-
strands. нообразию гамет, случайность слияния гамет при
оплодотворении, обмен частями между гомологич-
ными хромосомами – все это (и далеко не только
ÉÂÌÂÚ˘ÂÒ͇fl ÂÍÓÏ·Ë- это) относится к рекомбинации.
̇ˆËfl fl‚ÎflÂÚÒfl Ó‰ÌËÏ Понятно, что из широкого круга рекомбинаци-
ËÁ ÓÒÌÓ‚Ì˚ı ËÒÚÓ˜ÌËÍÓ‚ онных явлений интерес молекулярных биологов в
первую очередь вызывает рекомбинация, заключа-
̇ÒΉÒÚ‚ÂÌÌÓÈ ËÁÏÂÌ- ющаяся в обменах частями между молекулами
˜Ë‚ÓÒÚË. ùÚÓ ÓÔ‰ÂÎflÂÚ ДНК, ведь здесь можно применять весь арсенал ме-
 ‚‡ÊÌÛ˛ Óθ Í‡Í ‚ тодов генетики и молекулярной биологии, и эти ис-
следования перекрываются с изучением других
˝‚ÓβˆËË, Ú‡Í Ë ‚ ÓÌÚÓ- важных генетических процессов, прежде всего реп-
„ÂÌÂÚ˘ÂÒÍÓÈ ËÁÏÂ̘˂Ó- ликации и репарации ДНК. Но даже в таком виде,
ÒÚË. Ç Òڇڸ ‡ÒÒÏÓÚÂ- суженном до обменов частями молекул ДНК, поня-
тие “рекомбинация” включает большой набор раз-
Ì˚ ÔËÓ‰‡ Ë ÏÂı‡ÌËÁÏ˚ ных по своей природе явлений. При этом для всех
„ÓÏÓÎӄ˘ÌÓÈ (Ó·˘ÂÈ) рекомбинационных процессов общим является
ÂÍÓÏ·Ë̇ˆËË, „‰Â ‚Á‡Ë- этап, на котором молекулы ДНК вступают в кон-
такт в участке, где произойдет обмен полинуклео-
ÏÓ‰ÂÈÒÚ‚Ë (ÒË̇ÔÒËÒ) тидными цепями. Этот этап получил название “си-
ÏÂÊ‰Û ÂÍÓÏ·ËÌËÛ˛- напсис”. Однако механизм синапсиса при разных
˘ËÏË „ÓÏÓÎӄ˘Ì˚ÏË типах рекомбинации принципиально различен. Бо-
лее того, он является одним из критериев при клас-
© É·ÁÂ Ç.å., 1998

ÏÓÎÂÍÛ·ÏË ÓÒÌÓ‚‡ÌÓ Ì‡ сификации рекомбинационных явлений.


‚Á‡ËÏÌÓÏ ÛÁ̇‚‡ÌËË Ë Прежде чем перейти к их рассмотрению, напом-
ÒÔ‡Ë‚‡ÌËË ÍÓÏÔÎÂÏÂÌ- ним некоторые термины и понятия, которыми мы
Ú‡Ì˚ı ˆÂÔÂÈ Ñçä. 1
См. статьи: Фаворова О.О. Сохранение ДНК в ряду поко-
лений: репликация ДНК // Соросовский Образователь-
ный Журнал. 1996. № 4. С. 11–17; Сойфер В.Н. Репарация
генетических повреждений // Там же. 1997. № 8. С. 4–13.

ÉãÄáÖê Ç.å. ÉéåéãéÉàóçÄü ÉÖçÖíàóÖëäÄü êÖäéåÅàçÄñàü 13


будем пользоваться. Молекула ДНК представляет последовательности в гомологичном дуплексе и
собой дуплекс – структуру из двух закрученных в образуют с ними гетеродуплекс – ключевой проме-
спираль полинуклеотидных цепей1. Последователь- жуточный продукт (интермедиат) рекомбинации.
ность нуклеотидов в цепях определяет специфич- Конечным результатом рекомбинации будет обмен
ность ДНК и несет генетическую информацию. равными частями гомологичных молекул (рис. 1).
Молекулы, имеющие общее происхождение и со- Из общей рекомбинации можно выделить как
стоящие из одинаковых нуклеотидных последова- частный случай так называемую эктопическую ре-
тельностей, называют гомологичными. Однако их комбинацию. Она заключается в обменах (крос-
идентичность нарушается из-за мутаций, накапли- синговерах) между отдельными участками гомоло-
вающихся в течение поколений. По большей части гичной ДНК, разбросанными по геному. К ним
мутации приводят к заменам единичных нуклеоти- относятся разнообразные подвижные элементы,
дов, реже к выпадениям и вставкам отдельных нук- названные так за способность перемещаться по гено-
леотидов. Поэтому нарушения гомологии в резуль- му, гены транспортных и рибосомных РНК, гистонов
тате мутаций не очень существенны по сравнению с и многие другие повторяющиеся последовательнос-
основной массой идентичных нуклеотидов, и в та- ти (повторы) ДНК. Такая локальная гомологичная
ких случаях можно говорить об общей гомологии рекомбинация интересна прежде всего тем, что она
молекул. Каждая новая мутация приводит к образо- может приводить к хромосомным перестройкам,
ванию нового аллеля в том гене, где она возникла. хотя ее биологическая роль этим не исчерпывается.
Следовательно, новые аллели обычно отличаются На рис. 2 в качестве примера приведены схемы воз-
от исходной формы одним нуклеотидом. Если мута- никновения инверсий (поворотов внутренних уча-
ция приводит к изменению фенотипа у исходной стков хромосом на 180°), утрат (делеций) и удвое-
формы, то к ней можно применять также термин ний (дупликаций) частей хромосом в результате
“генетический маркер”. эктопической рекомбинации. Это только часть воз-
Две цепи, составляющие дуплекс ДНК, антипа- можных перестроек хромосом. Другие их типы мо-
раллельны, то есть имеют разную полярность: одна гут возникать в зависимости от того, какова ориен-
цепь имеет направление 5'–3', другая – 3'–5'. Цепи тация повторов ДНК по отношению друг к другу
удерживаются вместе водородными связями между (прямая или обратная), и от того, где они располо-
парами комплементарных оснований А–Т и G–C. жены: внутри одной хромосомы, в сестринских хро-
Поэтому обе цепи в дуплексе являются также ком- матидах или разных хромосомах. Несмотря на то,
плементарными. Процесс расхождения цепей в ре- что обмены происходят между локальными участ-
зультате разрыва водородных связей есть денату- ками гомологии, эктопическая рекомбинация осу-
рация, обратная реакция – ренатурация. Все это ществляется в основном теми же белками, что и го-
сказано для того, чтобы подвести читателя к отправ- мологичная. Принципиально иными являются три
ной идее статьи: поскольку отдельные цепи ДНК, других типа рекомбинации, которые основаны не
полученные от разных родителей, гомологичны и, на взаимодействии комплементарных цепей ДНК,
следовательно, комплементарны, они могут ренату- а на совершенно иных механизмах и участии иных
рировать, формируя новый дуплекс. Иными слова- белков. Пока ограничимся тем, что просто перечис-
ми, гомологичные ДНК могут узнавать друг друга лим их: сайт-специфическая2 рекомбинация, транс-
по комплементарности их нуклеотидной последо- позиции и незаконная рекомбинация. Этим типам
вательности. Новый дуплекс, состоящий из цепей рекомбинации посвящена следующая статья в этом
от разных молекул, называется гетеродуплексом. номере журнала.
А теперь можно дать классификацию основных
åéÑÖãú ïéããàÑÖü
типов рекомбинации. Все, что говорилось о гомо-
логии ДНК и комплементарности полинуклеотид- Рассмотрение гомологичной рекомбинации
ных цепей, относится к гомологичной, или общей, начнем с общей модели кроссинговера, опублико-
рекомбинации (она же кроссинговер), основанной ванной в 1964 году американским генетиком Р. Хол-
на спаривании комплементарных цепей ДНК. От лидеем. Сразу оговоримся, что Холлидей предло-
других типов рекомбинационных процессов ее от- жил эту модель с конкретной целью, а именно для
личают необходимость в общей (по всей длине мо- объяснения результатов, полученных им и другими
лекул) гомологии между рекомбинирующими ДНК исследователями генетики грибов. Модель была
и участие большого набора специальных белков. Го- формальной, без детализации молекулярных меха-
мологичная рекомбинация начинается с возникно- низмов рекомбинационных реакций, она не рас-
вения в одном или обоих дуплексах участков из оди- сматривала белки, их осуществляющие, поскольку
ночных цепей ДНК, которые затем с помощью в начале 60-х годов большинство из них не было из-
специальных белков находят комплементарные вестно. Но как раз в то время началось бурное раз-
витие молекулярной генетики и случилось так, что
1
Более подробно строение ДНК описано в статье: Кнор-
2
ре Д.Г. Биохимия нуклеиновых кислот // Соросовский Сайт – некая точка или участок в молекуле ДНК, РНК
Образовательный Журнал. 1996. № 3. С. 11–16. или белка.

14 ëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 1998


A B A B а f
A B A b
а a bcd e f g d'c'b' h e g
a b a B
a b a b

b'c'd'
bcd
a bc'd' g f e d c b' h a h

б
A B A b f
a bcd e f g b'c'd' h g e
б a b a B a bcd
f b' c'd' h
e
a bc'd' h + g
B A b C cd
b'
b B
A в
C
aX
X

g
c

a c a bcd e f g b'c'd' h f

b'c'd
a bcd e f g b'c'd' h
в e

a
bcd h

'
a bcd e f g b' c'd' h

C a bcd e f g b'c d e f g b'c'd' h


B
A B b a b c'd' h
b
A C
c

X
a a
c

Рис. 2. Схемы перестроек хромосом, осуществ-


ляющихся путем кроссинговера между повторяю-
в' щимися последовательностями ДНК: а – внутри-
молекулярная рекомбинация между обращенны-
ми повторами bcd и d'c'b' в участке между b и с
(здесь и далее апострофы позволяют различать
одинаковые части двух повторов) сопровождает-
ся поворотом на 180° (инверсией) участка efg, за-
ключенного между повторами; б – внутримолеку-
Рис. 1. Схемы гомологичной рекомбинации (крос- лярная рекомбинация по прямым повторам bcd и
синговера). Все линии соответствуют дуплексам b'c'd'. Для их вхождения в синапсис дуплекс ДНК
ДНК. Синий и красный цвет позволяет различать должен изогнуться в виде петли. Кроссинговер
гомологичные молекулы. Вертикальные черточки происходит на участке между b и c, что приводит к
изображают центромеры. Кроссинговер обозна- вырезанию сегмента хромосомы между участка-
чен знаком “Х”: а – кроссинговер в профазе 1-го ми кроссинговера и состыковке сегментов, рас-
деления мейоза. Четыре дуплекса ДНК здесь со- положенных снаружи от участков кроссинговера.
ответствуют хроматидам. Сестринские хромати- Вырезаемая последовательность (efg вместе с
ды соединены центромерой. Все хроматиды вме- одной копией повтора bcd) имеет кольцевую фор-
сте составляют тетраду. В каждом акте кроссинго- му; в – рекомбинация по прямым повторам bcd и
вера участвуют две хроматиды из четырех. В b'c'd' между сестринскими хроматидами (извест-
данном случае кроссинговер произошел между на также под названием “неравный кроссинго-
вер”). Ее результатом являются утрата (делеция)
двумя внутренними хроматидами. Продукты крос-
сегмента efg и одной копии повтора bcd в одной
синговера – две рекомбинантные и две нереком- хроматиде и их прибавление (дупликация) к дру-
бинантные хроматиды; б – кроссинговер в сома- гой хроматиде. Многократное повторение нерав-
тической клетке на стадии G1 клеточного цикла ного кроссинговера может привести к увеличе-
(клетки прошли через митотическое деление, но у нию количества (амплификации) генов в хромосо-
них не произошла репликация хромосом). Поэто- ме. Эта схема приложима и к рекомбинации
му здесь дуплекс ДНК соответствует хромосоме. между гомологичными хромосомами. Остальные
Отметим, что кроссинговер в G1-клетках не выяв- условные обозначения те же, что в рис. 1
ляется генетическими методами, но обнаружива-
ется физико-химическими методами; в – крос-
синговер в клетке кишечной палочки Escherichia новые экспериментальные результаты хорошо впи-
coli. Одна из участвующих в рекомбинации клеток сались в модель Холлидея, дополняя и уточняя ее.
(реципиент), имеющая кольцевую хромосому По существу история молекулярной генетики ре-
(красная), получила от клетки-донора линейный комбинации – это развитие модели Холлидея. В
фрагмент двуцепочечной ДНК (синий). Большая
часть донорного фрагмента замещает гомологич- усовершенствованном коллективными усилиями
ный участок в реципиентной хромосоме. Обраща- генетиков и молекулярных биологов виде модель
ем внимание на то, что здесь кроссинговер проис- представлена на рис. 3. Она разработана для мейо-
ходит дважды, вблизи обоих концов фрагмента. тического кроссинговера. Напомним, что ядро мей-
Единичный кроссинговер только на одном конце
фрагмента привел бы к гибельному для реципи-
отической клетки в профазе I содержит по четыре
ентной клетки разрыву хромосомы. Такая гипоте- гомологичных хроматиды, но в каждом отдельном
тическая ситуация изображена на рис. 1, в' акте кроссинговера участвуют только две из них. На

ÉãÄáÖê Ç.å. ÉéåéãéÉàóçÄü ÉÖçÖíàóÖëäÄü êÖäéåÅàçÄñàü 15


рис. 3 изображены два гомологичных дуплекса, со-
ответствующие хроматидам. Для простоты изобра-
жены только те две хроматиды из четырех, которые 4
участвуют в кроссинговере. 2
3
В принципе для того, чтобы гомологичные мо-
лекулы ДНК поменялись своими частями, сначала
должны произойти разрывы во всех цепях обоих
1
дуплексов, а уже потом – обмен цепями и замыка-
ние разрывов. У Холлидея разрывы происходят не
одновременно, а в два этапа. Рекомбинация начи- Рис. 4. Электронно-микроскопическая фото-
нается с первичных одноцепочечных разрывов фос- графия полухиазмы Холлидея. Рекомбинантная
фодиэфирных связей ДНК (их вносит фермент эн- структура выделена из хромосомной ДНК вегета-
донуклеаза). Разрывы происходят в двух цепях тивных клеток диплоидных дрожжей Saccharomy-
ces cerevisiae, находящихся в фазе G1 клеточного
одинаковой полярности (рис. 3, а). Холлидей также цикла. Хромосомная ДНК была обработана рес-
постулировал, что первичные разрывы возникают трикционной эндонуклеазой EcoRI. Поскольку
не в случайных, а в определенных сайтах ДНК. рестрикционная эндонуклеаза производит двуце-
почечные разрывы ДНК в определенном сайте, в
Впоследствии эта идея получила эксперименталь- случае гомологичной рекомбинации должна об-
ное подтверждение. разоваться попарно равноплечая крестообразная
структура. В данном случае ветвь 1 по длине рав-
Далее от точек первичных разрывов происходит на ветви 4, а ветвь 2 – ветви 3. Точка перекреста
обмен цепями между дуплексами, который приво- помечена знаком × . Пересечение цепей в правой
дит к образованию крестообразной структуры, по- части рисунка – результат их наложения друг на
лучившей впоследствии название “полухиазма друга при подготовке препарата к электронной
микроскопии. Фото М.П. Самадашвили и автора
Холлидея” (рис. 3, б и 4). Такое название объясняет-
ся тем, что в полухиазме в обмен вовлечены только полухиазме вдоль рекомбинирующих дуплексов
две цепи ДНК из четырех, что отличает ее от полной (рис. 3, в). Такое явление описано под названием
хиазмы – характерного продукта завершенного “миграция ветвления”. Оно заключается в следую-
мейотического кроссинговера, давно известного щем: от точки перекреста цепей происходит распле-
биологам. Затем происходит очень важный про- тание исходных дуплексов и высвобождающиеся
цесс – перемещение точки перекреста цепей в цепи тут же ренатурируют с комплементарными це-
пями из гомологичных дуплексов, что приводит к
5' A B C 3' образованию и последующему удлинению гетеро-
3' 5' A дуплекса (B/b на рис. 3, в). Именно в удлинении ге-
а C
3' 5' теродуплекса и заключается биологический смысл
5' 3'
a b c миграции ветвления. Ее осуществляют специаль-
A B C в' ные ферменты. Размеры гетеродуплекса при мейо-
тическом кроссинговере колеблются от нескольких
б c сот до одной тысячи п.н., при рекомбинации в со-
a b c
a матических клетках и клетках прокариот он еще
протяженнее.
A B C Гетеродуплекс сформирован. Образовавшаяся
в b A сложная разветвленная структура должна разде-
B C
2 литься на гомологи. Это называется разрешением
a b c полухиазмы. Для разрешения необходимы еще два
г 1 1 разрыва цепей: вторичные разрывы завершат обмен
A B C цепями. Но прежде чем это случится, полухиазма
c 2 a должна претерпеть еще одно превращение – изоме-
д b
B ризацию. Изомеризация заключается в изменении
a b c структуры полухиазмы, которое происходит за счет
обычного теплового движения молекул. На рис. 3
A B c изображена схема изомеризации полухиазмы, пред-
е b ложенная Х. Поттером и Д. Дресслером в 1976 году.
b Структуры в и в' идентичны: просто вторая изобра-
a B C жена в крестообразном виде, что приближает ее к
реальной (рис. 4). В структуре в' происходит один
Рис. 3. Модель Холлидея. В отличие от рис. 1 и 2 поворот на 180° любой пары дуплексных сегментов
линии соответствуют цепям ДНК, две параллель-
ные линии – дуплексу ДНК. Вертикальные черточ-
(плеч), на рисунке это нижняя пара. Образовавшаяся
ки на рис. 3, а отмечают сайты первичных разры- структура (рис. 3, г) может разрешиться двумя пара-
вов. Остальные пояснения даны в тексте ми вторичных разрывов. Парные разрывы цепей

16 ëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 1998


одинаковой полярности 1–1 или 2–2 приводят к ДНК в профазе мейоза Продукты мейоза
двум типам рекомбинантных хроматид: хроматиды A Нормальное
первого типа (рис. 3, д ) содержат внутренний гете- расщепление
родуплекс B/b, а по конфигурации фланговых мар- A
AA a
керов А и С не отличаются от исходных (некроссо- а a a
верные хроматиды); рекомбинантные хроматиды
второго типа (рис. 3, е) кроссоверные, они также со- a 2A:2a
держат гетеродуплекс, но обмениваются частями по A
обе стороны от него. Оба типа продуктов рекомби- Конверсия
A
нации равновероятны, что соответствует генетичес- A A
ким данным, на которые опирался Холлидей при A A
A a
создании своей модели. екц
ия a
A Ко
рр A
3A:1a
Здесь необходимо сделать небольшое отступле- a K
ние по поводу одного важного процесса, происхо- б A
a Ко A
дящего в гетеродуплексе. Как уже указывалось, от a рр
ек
Конверсия
исходных молекул в рекомбинационный гетеродуп- K
a ци a
я
Aa a
лекс могут войти разные аллели, и тогда в нем воз- a a
никнут неспаренные основания, которые локально
a 1A:3a
нарушат структуру двойной спирали ДНК. Эти на-
рушения узнаются специальными ферментными
системами, работающими по типу эксцизионной Рис. 5. Сокращенная схема конверсии гена на
репарации (см. статью В.Н. Сойфера “Репарация примере дрожжей. Линии соответствуют цепям
генетических повреждений”). Они проводят кор- ДНК, две параллельные линии – хроматиде. У
дрожжей, как и у других грибов-аскомицетов,
рекцию неспаренных оснований в гетеродуплексе: продукты каждого мейоза какое-то время сохра-
удаляют неспаренное основание в одной цепи ДНК няются вместе в сумке-аске (заключены в окруж-
и застраивают образующуюся брешь по матрице ность), что позволяет анализировать их отдельно
от других мейозов: а – мейоз без кроссинговера;
другого аллеля в комплементарной цепи, тем самым б – мейотический кроссинговер в участке гена А.
превращая (конвертируя) один аллель в другой. Это Остальные пояснения даны в тексте
явление было давно известно под названием “кон-
версия гена”, но теперь мы знаем, что в ее основе ном дуплексе, затем от точки разрыва отделяется
лежит коррекция гетеродуплекса. Схема конверсии одна цепь ДНК, которая внедряется в гомологич-
гена на примере мейоза у дрожжей представлена на ный дуплекс и в ходе последующей миграции ветв-
рис. 5. Из нее ясно, что если гетерозиготная клетка ления вытесняет из него цепь той же полярности.
A/a вступает в мейоз, то в норме среди продуктов После этого обмен превращается в симметричный.
мейоза оба аллеля гена A будут представлены в рав- Пример такой реакции, но применительно к E. coli
ном соотношении: 2A : 2a. Однако если в районе будет рассмотрен ниже.
хромосомы, где расположен ген A, произойдет Модель Холлидея в ее современном виде обще-
кроссинговер, то сформируется гетеродуплекс A/a признана и универсальна для прокариот и эукариот
с локально неспаренными основаниями, что может (и для половых, и для соматических клеток). Ее до-
привести к конверсии гена A: расщепление аллелей стоинством является тот факт, что она хорошо про-
гена среди продуктов мейоза будет 3A : 1a или 1A : 3a. веряется генетическими данными, и практически
Расщепление по генам, расположенным вне участ- все ее этапы постепенно нашли экспериментальное
ка кроссинговера (на рис. 5 не показаны), сохранит подтверждение. Полухиазмы Холлидея хорошо
нормальное соотношение аллелей 2 : 2. Мы видели видны под электронным микроскопом (см. рис. 4).
при разборе модели Холлидея, что содержащие ге- Обнаружены специальные эндонуклеазы (их назы-
теродуплекс продукты рекомбинации с кроссинго- вают резолвазами), которые осуществляют разре-
вером и без кроссинговера по внешним генам рав- шение полухиазмы, как это изображено на рис. 3, г.
новероятны, иными словами, конверсия гена в К настоящему времени такие резолвазы обнаруже-
мейозе может одинаково часто сопровождаться и не ны у бактериофагов T4 и T7, E. coli, дрожжей и чело-
сопровождаться обменом по внешним генам. Этот века. У E. coli выявлены также белки, осуществляю-
факт был основным среди упомянутых выше гене- щие миграцию ветвления полухиазмы. Именно на
тических данных, опираясь на которые Холлидей примере E. coli как наиболее изученного в отноше-
создавал свою модель. нии рекомбинации объекта мы рассмотрим кон-
Модель Холлидея симметрична: первичные раз- кретные механизмы кроссинговера.
рывы возникают одновременно в обоих гомологах и
обмен цепями происходит синхронно. Однако име- êÖäéåÅàçÄñàü ì E. COLI: ÉÖçÖíàóÖëäàâ
ются генетические данные об асимметричных об- äéçíêéãú à åéãÖäìãüêçõâ åÖïÄçàáå
менах, полученные, в частности, на дрожжах. В этих Клетки E. coli способны к обмену генетической ин-
случаях первичный разрыв возникает только в од- формацией с помощью двух процессов, заменяющих

ÉãÄáÖê Ç.å. ÉéåéãéÉàóçÄü ÉÖçÖíàóÖëäÄü êÖäéåÅàçÄñàü 17


им половой: конъюгации и трансдукции. При конъ- Первый сайт используется для первичного связыва-
югации клетки разных половых типов вступают в ния с ДНК: в присутствии АТФ белок всегда взаи-
контакт, и из клетки донора в клетку реципиента модействует в этом сайте с одноцепочечной ДНК.
передается одна из двух цепей кольцевой ДНК (хро- Связывание белка носит кооперативный характер,
мосомы или конъюгативной плазмиды, если по- то есть его молекулы собираются на ДНК по прин-
следняя не интегрирована в хромосоме). При этом ципу “конец-в-конец”, образуя вокруг ДНК право-
конъюгирующие пары бактериальных клеток по- закрученную белковую спираль (не надо путать ее
степенно расходятся из-за непрочной связи между со спиралью самой ДНК). В результате возникает
ними, и перенос ДНК сразу прекращается. Поэтому нитевидное образование – RecA-ДНК-филамент.
реципиентные клетки никогда не получают от до- Если одноцепочечная ДНК была в составе двуцепо-
нора полную однонитевую кольцевую хромосом- чечной молекулы (как хвост или брешь), то форми-
ную ДНК, а только ее часть, которая сразу достраи- рование филамента распространяется на дуплекс,
вается до линейного двуцепочечного фрагмента с что сопровождается гидролизом АТФ. В филаменте
так называемыми тупыми концами (у них нет вы- двуцепочечная ДНК изменяет свою конформацию.
ступающих одноцепочечных концов – “хвостов”). В отличие от обычной В-формы ДНК (где шаг спи-
Размеры перенесенных фрагментов варьируют, ча- рали составляет 10,4 п.н.) на один виток спирали
ще всего они достигают нескольких сот т.п.н. При ДНК в филаменте приходятся 18,6 п.н., в результате
трансдукции из клеток донора в клетку реципиента чего ДНК оказывается растянутой в 1,5 раза. Счита-
с помощью бактериофага (бактериального вируса) ется, что такое растяжение дуплекса необходимо
переносится двуцепочечный фрагмент бактериаль-
ной хромосомы, но в десятки раз меньшего размера, а б в
чем при конъюгации. Таким образом, с физической
точки зрения генетический материал, передавае-
мый реципиентам при конъюгации и трансдукции, 1 + 1 + 1 +
отличается только размерами. Далее донорный
фрагмент должен заменить гомологичную часть
хромосомы реципиента с помощью парных крос-
синговеров, проходящих вблизи концов фрагмента
(см. рис. 1, в).
Рассмотрим механизм самого кроссинговера у 5'
E. coli. На начальной стадии исследований в лабора- 2 2 2
3' 3'
тории А. Кларка в США был выделен и изучен на- 5'
Миграция
бор мутантов с нарушениями рекомбинации (у них ветвления
была подавлена способность давать рекомбинант-
ное потомство при конъюгации и трансдукции). С
помощью этих мутантов, названных rec, были уста-
новлены соответствующие гены, а затем выделены 3 + 3
рекомбинационные белки, инактивированные у
мутантов.
Самый главный белок RecA – продукт гена recA. Рис. 6. Схемы трех рекомбинационных реакций,
осуществляемых белком RecA E.coli in vitro (из:
Белок имеет небольшой размер (всего около 38 кД) Smith G.R. // Ann. Rev. Genet. 1987. Vol. 21. P. 179–
и проявляет разнообразные активности. Этот белок 201, с изменениями). Линии соответствуют цепям
участвует не только в рекомбинации, но и в репара- ДНК. Вертикальными черточками на этапе 2 изоб-
ражены водородные связи. Они даны для выделе-
ции ДНК. Мы рассмотрим только его роль в реком- ния участка вновь образованного гетеродуплекса
бинации. В условиях in vitro для проявления всех в D-петле. RecA-ДНК-филамент на рисунке не по-
активностей белка RecA требуются в качестве ко- казан: а – реакция между кольцевой двуцепочеч-
факторов АТФ и одноцепочечная ДНК в любой ной ДНК и гомологичной одноцепочечной ДНК.
Для эффективной реакции кольцевая ДНК должна
форме, например дуплексная ДНК с концевыми быть сверхспирализована, на рисунке это не по-
(хвосты) или внутренними (бреши) одноцепочеч- казано. Одноцепочечная ДНК внедряется в коль-
ными участками. Основное назначение белка RecA – цевой дуплекс в участке, гомологичном ее концу,
и образует D-петлю; б – реакция между кольцевой
приводить во взаимодействие одноцепочечную одноцепочечной ДНК и гомологичным линейным
ДНК с гомологичным дуплексом. В зависимости от дуплексом. На этапе 2 показаны интермедиат ре-
структуры ДНК-субстратов белок может проводить акции с D-петлей и направление последующей
разные рекомбинационные реакции. Три из них по- миграции ветвления, которая приведет к появле-
нию продуктов рекомбинации: кольцевого дуп-
казаны на рис. 6. Прежде чем рассматривать эти ре- лекса с одноцепочечным разрывом и линейной
акции, отметим некоторые общие закономерности одноцепочечной ДНК (этап 3 ); в – рекомбинация
функционирования RecA-белка. между гомологичными дуплексами, один из кото-
рых имеет одноцепочечный конец. Образование
Важнейшее свойство белка RecA определяется D-петли и затем полухиазмы Холлидея (этап 2),
наличием у него двух сайтов связывания с ДНК. миграция полухиазмы влево (этап 3 )

18 ëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 1998


для его последующего взаимодействия с гомологич- три разных пути гомологичной рекомбинации, но
ной одноцепочечной ДНК. Формирование фила- ни один из них не функционирует без RecA-белка.
мента завершает подготовительную, пресинаптиче- А теперь посмотрим, как осуществляется основ-
скую стадию кроссинговера. ной путь рекомбинации у E. coli – RecBCD. Главную
Реакции, составляющие следующую, синапти- роль здесь играет фермент RecBCD-нуклеаза, субъ-
ческую стадию кроссинговера, происходят только единицы которой кодируются генами recB, recC и
внутри филаментов. При этом филаменты могут recD. Фермент проявляет несколько активностей
вступать в рекомбинацию только с “голой”, не на- только в присутствии АТФ. RecBCD может гидро-
ходящейся в филаменте ДНК. Два филамента не ре- лизовать одно- и двуцепочечную ДНК, притом с
комбинируют друг с другом. Взаимодействие фила- обоих концов, то есть работать как экзонуклеаза.
мента с голой ДНК осуществляется за счет второго Он имеет также хеликазную активность, то есть рас-
сайта связывания RecA. Связывание с ДНК во вто- плетает дуплекс ДНК, затрачивая на это энергию
ром сайте слабое. Из-за этого между филаментом и АТФ. Наконец, фермент работает как сайт-специфи-
голой ДНК возникают лишь кратковременные кон- ческая эндонуклеаза: расщепляет одноцепочечную
такты (соударения). Эти контакты становятся проч- ДНК около особой 8-нуклеотидной последователь-
ными только после встречи гомологичных последо- ности 5'-GCTGGTGG-3', называемой Chi-сайтом.
вательностей. RecBCD-нуклеаза – один из самых ранних бел-
Нахождение гомологии связано с формировани- ков рекомбинации. Она готовит субстрат для белка
ем гетеродуплекса. Обычно оно начинается с обра- RecA. Напомним, что при конъюгации и трансдук-
зования структуры, в которой задействованы три ции в реципиентной клетке оказывается линейный
цепи ДНК и которая называется D-петлей (от англ. дуплекс донорной ДНК с тупыми концами. Именно
displacement loop – петля вытеснения). Это проис- такая ДНК необходима для рекомбинации с реци-
ходит следующим образом: одноцепочечная ДНК пиентной хромосомой с участием RecBCD. Ниже
внедряется в дуплекс (рис. 6, а) и образует двойную приводится схема работы фермента, основанная на
спираль (гетеродуплекс) с одной, комплементарной экспериментальных данных и подтвержденная элек-
ей цепью дуплекса, одновременно вытесняя вторую тронно-микроскопическими наблюдениями. Фер-
цепь. D-петля может быть закрытой, если в дуплекс мент атакует конец дуплекса и начинает расплетать
внедряется одноцепочечный хвост (рис. 6, а), или его (рис. 7, а). Реакция асимметрична, что проявля-
открытой, если она формируется на конце линей- ется в особой роли цепи ДНК с 3'-концом. RecBCD
ного дуплекса (рис. 6, б и в). удерживает его таким образом, что образуется одно-
цепочечная петля примерно в тысячу нуклеотидов
На следующем этапе – постсинапсисе гетеро- длиной, тогда как 5'-цепь выступает в виде свободно-
дуплекс удлиняется путем миграции ветвления, ко- го хвоста. Продолжая расплетать дуплекс, RecBCD-
торую in vitro также может осуществлять белок RecA. нуклеаза сохраняет петлю в 3'-цепи и продвигает
В случае рекомбинации между одноцепочечной ее вдоль дуплекса. Поскольку после прохождения
ДНК и дуплексом она происходит в определенном фермента комплементарные цепи ренатурируют
направлении, полярно, как показано на рис. 6, б. (“схлопываются”), в 5'-цепи автоматически возни-
Эта полярность определяется активной (рекомби- кает вторая петля (рис. 7, б ). Двойная петля продви-
ногенной) ролью 3'-концевой одноцепочечной ДНК гается вдоль дуплекса до тех пор, пока фермент не
в реакции, катализируемой белком RecA. Миграция встретит Chi-сайт в 3'-цепи. Фермент должен по-
ветвления под действием RecA-белка сопровожда- дойти к Chi-сайту справа, с 3'-стороны. На рассто-
ется гидролизом АТФ, но происходит медленно, со янии 4–6 нуклеотидов до него RecBCD разрывает
скоростью несколько п.н./с. Таким образом, в усло- 3'-цепь (рис. 7, в) (вспомните о постулированных
виях in vitro белок RecA способен осуществлять по- Холлидеем особых последовательностях ДНК, в ко-
иск гомологии, формировать синаптическую струк- торых происходят первичные разрывы цепей). Даль-
туру на основе гетеродуплекса и производить обмен нейшее расплетание дуплекса приводит к вытесне-
цепями между гомологами. Эти реакции стимули- нию рекомбиногенного одноцепочечного 3'-конца
руются добавлением белка SSB, который выпрям- (рис. 7, г, д ), который связывается с белком RecA.
ляет одноцепочечную ДНК. После этого происходит уже известная цепь собы-
Мы рассмотрели реакции, катализируемые бел- тий. На 3'-конце сначала формируется филамент,
ком RecA in vitro. В условиях in vivo, то есть в бакте- затем образуется D-петля (закрытая, так как воз-
риальной клетке, где вместе с RecA задействованы никает в кольцевой хромосоме) (рис. 7, е). Затем
другие белки, распределение обязанностей может D-петля разрезается с помощью одной из эндонук-
быть несколько иным. Например, в клетке белок леаз E. coli, что приводит к полухиазме Холлидея
RecA не проводит миграцию ветвления. Это более (рис. 7, ж). 5'-Концевая часть разорванной цепи
эффективно делают другие специальные белки. На- ДНК, вероятно, удаляется несколько раньше
до отметить, что разнообразие белков, работающих (рис. 7, г) с помощью экзонуклеазной активности
вместе с RecA, отражает разнообразие путей реком- RecBCD. На этом участие белков RecA и RecBCD в
бинации. Еще в 1973 году А. Кларк описал у E. coli рекомбинации, скорее всего, завершается. Далее

ÉãÄáÖê Ç.å. ÉéåéãéÉàóçÄü ÉÖçÖíàóÖëäÄü êÖäéåÅàçÄñàü 19


а 5' б в г
5' 5' 5'
3' 3' 3' 3'

Chi
Chi Chi
Ch
3' 5' i
3'
д е ж з
5' 5'
3' 3' 3'
Chi Chi 3' Chi
3' 3' 3' 5'
5'

Рис. 7. Сокращенная схема рекомбинации с участием RecBCD-нуклеазы E. coli (из: Smith G.R. // Ann. Rev. Genet.
1987. Vol. 21. P. 179–201, с изменениями). Дуплексы ДНК представлены параллельными линиями. Синие линии –
фрагмент донорной ДНК, красные линии – часть кольцевой хромосомы реципиентной клетки. Желтый прямо-
угольник изображает молекулу RecBCD-нуклеазы, пунктир – репаративный синтез бреши с помощью ДНК-поли-
меразы. Остальные пояснения даны в тексте

ДНК-полимераза и ДНК-лигаза должны залечить фических сайтах инициации кроссинговера). Раз-


брешь и разрывы в цепях (рис. 7, з). рывы сопровождались деградацией 5'-концевых це-
Последующие этапы, не представленные на пей с каждой стороны разрыва, что приводило к
рис. 7, – миграцию ветвления и разрешение полу- образованию одноцепочечных 3'-хвостов длиной
хиазмы осуществляют другие белки. Из них наибо- около 600 п.н. Модель представлена на рис. 8. В
лее изучены RuvA, RuvB и RuvC – продукты генов 1994 году две группы исследователей из США выде-
ruvA, ruvB и ruvC. RuvA узнает крестообразную по- лили из мейотических клеток дрожжей структуры,
лухиазму и нацеливает на нее RuvB. Последний состоящие из двух гомологичных дуплексов, удер-
узнает комплекс RuvA–полухиазма и, используя живаемых вместе двумя полухиазмами Холлидея.
энергию АТФ и работая как ДНК-хеликаза, осуще- Структуры точно соответствуют интермедиату мо-
ствляет миграцию полухиазмы в том же направле- дели, изображенному на рис. 8, г. В реакции in vitro
нии, что и RecA-белок in vitro, но гораздо эффек- они разрешаются с помощью резолвазы из E. coli на
тивнее. Где-то здесь в игру вступает резолваза RuvC: два дуплекса, либо кроссоверных, либо некроссовер-
она узнает комплекс RuvB–полухиазма, связывает- ных по внешним маркерам. Детали этого механизма
ся с ним и в определенный момент разрешает полу- применительно к условиям in vitro еще уточняются,
хиазму способом, описанным выше (рис. 3, г). На однако он обнаружен пока только у дрожжей.
этом миграция полухиазмы прекращается.
На рис. 7 инициация рекомбинации для просто- áÄäãûóÖçàÖ
ты изображена только на одном конце фрагмента Мы рассмотрели механизмы гомологичной ре-
донорной ДНК. В действительности же вся описан- комбинации на примере двух хорошо изученных
ная последовательность реакций происходит одно- организмов: дрожжей и E. coli. В основных чертах
временно с обоих концов донорного фрагмента, что описанные процессы, прежде всего те, что основа-
обеспечивает парность обменов при рекомбинации ны на схеме Холлидея, характерны и для других ор-
с хромосомой реципиента и исключает ситуацию, ганизмов, в том числе высших эукариот. В пользу
изображенную на рис. 1, в'. Перечисленные выше этого свидетельствуют участие структуры Холлидея
белки далеко не исчерпывают список участников и сходного набора белков в рекомбинации у пред-
кроссинговера у E. coli. Сюда входят также различ- ставителей всех систематических групп организмов
ные белки, помогающие RecA, белки, участвующие и эволюционный консерватизм белка RecA. Его го-
в альтернативных путях рекомбинации, и белки об- мологи обнаружены у бактерий, грибов, растений и
щего метаболизма ДНК: ДНК-гираза, ДНК-полиме- животных, включая человека, хотя многие детали
раза, ДНК-лигаза и группа белков, осуществляющих их функционирования еще не выяснены. В то же
коррекцию неспаренных оснований в рекомбинаци- время механизмы рекомбинации у разных организ-
онном гетеродуплексе. мов могут существенно различаться в деталях. Так,
описанная выше RecBCD-нуклеаза, поставляющая
åéÑÖãú êÖäéåÅàçÄñàà çÄ éëçéÇÖ для рекомбинации одноцепочечную 3'-концевую
êÖèÄêÄñàà ÑÇìñÖèéóÖóçõï êÄáêõÇéÇ Ñçä ДНК, обнаружена только у бактерий. У других орга-
В последние годы получила развитие модель, низмов рекомбиногенная одноцепочечная ДНК об-
предложенная еще в 1983 году Дж. Жостаком и др. разуется другими способами.
для репарации двуцепочечных повреждений ДНК у Биологическое значение гомологичной реком-
дрожжей. Интерес к ней резко возрос после обнару- бинации огромно. Прежде всего она вносит боль-
жения специфических двуцепочечных разрывов в шой вклад в лежащую в основе эволюции генетиче-
генах ARG4 и HIS4, возникающих только в мейозе и скую изменчивость, позволяющую организмам
совпадающих с сайтами инициации рекомбинации постоянно приспосабливаться к среде обитания.
(вспомните о постулированных Холлидеем специ- Преимущества перекомбинаций генов настолько

20 ëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 1998


5' ет собственный промотор и может функциониро-
а
3' вать, в то время как в других локусах находятся по-
следовательности, в основном гомологичные этому
гену, но заметно отличающиеся по нуклеотидному
составу из-за накопившихся в них мутаций. Они
Эндонуклеаза
лишены промотора и не могут выполнять функции
5' генов. Эти “молчащие” последовательности могут
б
3' вступать в синапсис с работающим геном и служить
матрицей для его конверсии. Таким образом, рабо-
тающий ген может менять свою нуклеотидную по-
5'-3'-Экзонуклеаза
следовательность. Подобным способом клетки го-
моталличных штаммов дрожжей меняют свой
половой тип.
в У некоторых патогенных микроорганизмов этот
же механизм, позволяющий их клеткам менять свои
поверхностные антигены, участвует в процессах,
Синапсис описанных ниже. Так, многие патогенные бактерии
и репаративный (спирохета Borrelia bormsei, гонококки и др.) и про-
синтез
стейшие (африканские трипаносомы), с одной сто-
роны, и животные, в которых они паразитируют, –
г
с другой, используют в борьбе друг против друга в
сущности сходные приемы. Животные продуциру-
ют в огромном ассортименте антитела, обеспечива-
Рис. 8. Схема мейотической рекомбинации по ющие им иммунитет1, а патогенные микроорганиз-
механизму репарации двуцепочечных разрывов
ДНК у дрожжей. Два гомологичных дуплекса ДНК мы в ответ на это образуют на своей поверхности все
(хроматиды) представлены парами параллельных новые и новые антигены, позволяющие им уходить
линий (а). Специфическая эндонуклеаза вводит от иммунного ответа хозяйского организма. В осно-
разрывы в обе цепи синего дуплекса (б). 5'-Концы ве данных процессов лежат рекомбинационные пе-
цепей в точках разрывов гидролизуются 5'-3'-эк-
зонуклеазой с образованием рекомбиногенных рестройки в локусах, кодирующих антигены (или
3'-цепей (в), которые внедряются в красный дуп- антитела). Рекомбинационные перестройки вклю-
лекс (г), где происходят репаративный синтез ут- чают одни и выключают другие гены либо создают
раченных участков ДНК (пунктир) и лигирование новые гены. В этих сложных процессах участвуют
концов. Остальные пояснения даны в тексте
разные типы рекомбинации, но гомологичная и эк-
велики, что рекомбинационные системы появи- топическая рекомбинации (и в том числе конверсия
лись у вирусов и бактерий, которые размножаются гена) играют здесь не последнюю роль. Помимо
вегетативно. У эукариот они достигли большего описанных процессов у бактерий и низших эукари-
разнообразия и сложности, особенно в соматичес- от известны и другие рекомбинационные системы,
ких клетках. Эктопическая рекомбинация приво- участвующие в регуляции работы генов. Но это тема
дит к перестройкам хромосом, с которыми (прежде следующей статьи.
всего с дупликациями) связывают эволюцию гене-
тического аппарата. Считается, что дупликации êÖäéåÖçÑìÖåÄü ãàíÖêÄíìêÄ
участков хромосом обеспечили материал для дивер- 1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная
генции нуклеотидных последовательностей, приво- биология клетки: Пер. с англ. М.: Мир, 1994. Т. 1, ч. 2.
дящей к возникновению новых генов. С. 301–310.
Однако биологическое значение гомологичной, 2. Инге-Вечтомов С.Г. Введение в молекулярную гене-
и в том числе эктопической, рекомбинации нельзя тику. М.: Высш. шк., 1983. С. 120–136.
свести к их роли в эволюции. Большую роль они 3. Льюин Б. Гены. Пер. с англ. М.: Мир, 1987. С. 443–453.
играют и в разнообразных онтогенетических пере-
стройках генетического материала, участвующих в * * *
регуляции работы генов. Например, конверсия гена Вадим Моисеевич Глазер, кандидат биологиче-
(коррекция гетеродуплекса), которая в мейотичес- ских наук, доцент кафедры генетики Московского
ких клетках является одним из этапов общего про- государственного университета им. М.В. Ломоно-
цесса кроссинговера, в соматических клетках эука- сова. Автор более 100 публикаций в области гене-
риот и клетках бактерий может не сопровождаться тики микроорганизмов и молекулярной генетики и
кроссинговером по внешним генам и выступать как двух учебно-методических пособий.
самостоятельное явление. Такая конверсия выпол-
няет важные функции в онтогенезе бактерий, дрож- 1
См. статью: Абелев Г.И. Основы приобретенного имму-
жей, животных. Известно много примеров, когда нитета // Соросовский Образовательный журнал. 1996.
определенный ген расположен в локусе, где он име- № 5. С. 4–10.

ÉãÄáÖê Ç.å. ÉéåéãéÉàóçÄü ÉÖçÖíàóÖëäÄü êÖäéåÅàçÄñàü 21

Оценить