«ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ

МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Доклад
на тему: «Лабораторные испытания (in vitro): физические,
химические, физико-химические, химические, микробиологические,
токсикологические и др.»

Выполнила: Гасанова Лиана, 305Б группа

Проверила: Адак А.
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Цели доклинических исследований

Основная идея доКИ — в обосновании целесообразности проведения последующих КИ,
после которых новые вещества смогут войти в состав готовых продуктов. Пренебрежение
доКИ чревато массой проблем. В лучшем случае будет потрачено очень много денег и
времени на дальнейшие исследования неэффективного препарата. В худшем — участники
КИ получат опасный для их здоровья препарат, что может привести к серьезным побочным
эффектам и даже смерти.

У доклинических исследований существуют вполне определенные цели. Этичность доКИ с

участием животных обеспечивается в том числе правильным планированием экспериментов
— они должны быть направлены на получение необходимых данных. К целям доКИ
относятся:

 проверка биологического действия (как полезного, так и токсического) различных

веществ;
 определение биологически активных доз действующих веществ;
 выбор потенциальной стартовой дозы в будущих клинических исследованиях с
участием добровольцев, определение диапазона безопасных доз и других параметров,
необходимых для планирования КИ первой фазы;
 установление клинического пути введения и его безопасности;
 обоснование критериев отбора добровольцев/пациентов для включения в клинические
исследования;
 определение физиологических параметров, подлежащих контролю в ходе
клинического наблюдения с участием людей;
 выявление потенциальных рисков для здоровья не только пациентов, но и других
людей (например, для населения в целом, ухаживающих лиц, членов семьи, близких и
интимных контактов).

Виды доклинических исследований

ДоКИ можно разделить на разные типы в зависимости от целей, субъектов исследований и
исследуемых параметров (табл. 1).

Таблица 1. Какими бывают доклинические

исследования

По предназначению результатов:
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

поисковые регуляторные (пилотные,

(фундаментальные, опорные)
трансляционные)

По изучаемым параметрам:

фармакологические токсикологические (общие и

(фармакодинамиче специфические виды
ские и токсичности, токсикокинетика,
фармакокинетическ исследования экологической
ие) безопасности)

По используемой модели:

in in in
silico (компьютерн vitro(клеточ vivo(исследова
ая модель) ная ния на
культура) животных)

Поисковые и регуляторные исследования

По использованию получаемых результатов можно выделить поисковые(фундаментальные,
трансляционные) и регуляторные (пилотные и опорные) исследования.

К поисковым, или нерегуляторным,исследованиям можно отнести всё, что помогает

сформировать правильные гипотезы и цели для последующей разработки нового
лекарства. Фундаментальные исследованияво всём их многообразии изучают мишень для
будущего лекарства. Они проводятся для изучения механизмов развития заболеваний,
деталей биохимических взаимодействий в живых организмах и так далее. Такие
исследования в основном проводят на клетках, а животных «подключают» для проверки
гипотез, предварительно полученных in vitro. Трансляционные исследования изучают
возможность какого-либо влияния на выбранную мишень с точки зрения лечения
заболеваний, то есть являются первым «мостиком» для переноса научного знания в
плоскость реального применения в медицине.

Важно отметить, что проведение поисковых исследований не урегулировано законодательно,

т.е. нет строгих юридических требований в отношении используемых моделей, дизайна,
размера выборки, оформления отчетов и т.д. Параметры исследований и модели
определяются исключительно научными соображениями. Результаты этих исследований
обычно не включаются в регистрационное досье, поскольку большинство из них касаются
молекул-кандидатов, так и не доходящих до последующих этапов разработки. Задача
поисковых исследований — найти несколько многообещающих кандидатов, которые можно
было бы начать изучать в КИ.
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

После того, как разработчик по результатам поисковых клинических исследований приходит

к выводу, что можно начать испытания с участием добровольцев, ему необходимо
подготовить почву для проведения будущих экспериментов. Для этого инициируются
регуляторные доКИ. Данное понятие предполагает, что существуют определенные
юридически обязывающие критерии, которые должны быть выполнены при планировании,
проведении, анализе, интерпретации и документальном оформлении таких исследований,
поскольку на их основании впоследствии будет разрешаться изучение лекарства с участием
людей.

Регуляторные исследования (пилотные и опорные) уже относятся к конкретному

кандидату и изучению его действия, а их результаты влияют на получение последующих
разрешений на КИ. Пилотные исследованияпроводятся для четкого определения
параметров (например, дозы, режима дозирования, частоты введения, времени взятия
образцов и др.) опорных исследований. Пилотными являются, например, работы с целью
определения подходящих видов животных для последующих доКИ или же изучение
диапазона токсических доз для выбранных животных.

Опорные исследования проводят, чтобы получить разрешение на КИ. Они уже отвечают на
вопросы, заявленные в целях исследования, а их результаты включаются в регистрационное
досье будущего препарата с целью обоснования проведения испытаний с участием
добровольцев и регистрации средства.

Итак, строго регламентируются и контролируются только опорные доКИ, так как это,
главным образом, исследования безопасности, необходимые для максимального снижения
рисков для людей в КИ — об этом мы расскажем в соответствующем разделе ниже.

Фармакологические и токсикологические исследования

По изучаемым параметрам традиционно
выделяют фармакологические и токсикологические исследования. Они могут
проводиться в рамках как пилотных, так и опорных доКИ. Однако большой объем
фармакологических исследований выполняется еще до начала регуляторной разработки, т.е.
на поисковом этапе.

Фармакологические испытания нужны, чтобы изучить, как именно вещество будет

воздействовать на человека или патогенные микроорганизмы и что происходит с целевым
веществом после того, как оно попадет в организм. С другой стороны, токсикологические
исследованияподразумевают намеренное использование высоких доз исследуемого
кандидата, заведомо превышающих предполагаемую терапевтическую дозу, для определения
диапазонов его токсичности и ее конкретных проявлений (табл. 2).

Таблица 2. Фармакологические и
токсикологические исследования. Синим
цветомотмечены исследования, проводимые в
соответствии с правилами GLP.
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Классификация доклинических исследований по

изучаемым параметрам

Фармакологические Токсикологические

Фармакодинамические: Общие виды

токсичности:
 Первичная
(основная)  Общетоксические
фармакодинамика свойства
 Вторичная  Генотоксичность
(второстепенная)
 Канцерогенность
фармакодинамика
 Репродуктивная и
 Фармакологическ
онтогенетическая
ая безопасность
токсичность
— в т.ч.
исследование
потенциала
лекарственной
зависимости
 Фармакодинамич
еские
лекарственные
взаимодействия

Фармакокинетические: Специфические виды

токсичности:
 Абсорбция
 Местная
 Распределение и переносимость
биораспределени
е  Иммунотоксичнос
ть
 Метаболизм
 Фотобезопасность
 Выведение
 Эндокринотоксич
 Фармакокинетиче ность
ские
лекарственные  Токсичность для
взаимодействия неполовозрелых
животных
 Туморогенность и
др.

Токсикокинетика

Исследования
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

экологической
безопасности

В группе фармакологических исследований выделяют фармакодинамические и

фармакокинетические исследования.

ФАРМАКОДИНАМИКА
раздел фармакологии, изучающий локализацию, механизм действия и
фармакологические эффекты лекарственных средств, силу и длительность их
действия. Иными словами, фармакодинамика отвечает на вопрос: «Как лекарство
влияет на организм?»

ФАРМАКОКИНЕТИКА
раздел фармакологии, изучающий кинетические закономерности химических и
биологических процессов, происходящих с ЛС в организме (абсорбция,
биораспределение, метаболизм, выведение). Таким образом, фармакокинетика
отвечает на вопрос: «Как организм влияет на лекарство?»

Токсикологию, в свою очередь, делят на исследования общих,

специфических видов токсичности, токсикокинетику, а также
исследования экологической безопасности.

Фармакологические исследования: фармакодинамика и фармакокинетика

Разберемся чуть подробнее, из чего состоят фармакологические исследования.

Первая задача фармакодинамики — определить, является ли новое вещество эффективным.

Для этого ученые в рамках тестов для оценки первичной фармакодинамики изучают, как
препарат влияет на системы организма, на лечение которых он направлен.

Изучение вторичной, или второстепенной, фармакодинамики, напротив, дает информацию о

том, как препарат действует на системы организма, в работу которых создатели средства
изначально вмешиваться не стремились. И чаще всего, что ожидаемо, такое непредвиденное
воздействие оказывается неблагоприятным. Здесь мы вплотную подходим ко второй цели
фармакологических тестов — исследованию фармакологической безопасности, где
оценивают негативные эффекты желательного фармакологического действия, если
терапевтические дозы превышены. Это очень важное исследование, необходимое для
последующей регистрации любого препарата, прошедшего доКИ. Более того, исследования
фармакологической безопасности так же, как токсикологические исследования, строго
регламентируются правилами надлежащей лабораторной практики GLP, о которых мы
поговорим в следующем разделе .

Фармакологическая безопасность и токсикология — самая важная часть регуляторных доКИ: все эти
испытания входят в так называемые доклинические исследования безопасности и нужны для того,
чтобы снизить риски побочных эффектов от лекарств для будущих пациентов (в таблице 2 они выделены
синим цветом). Если вещество впоследствии окажется просто неэффективным, это полбеды: тогда
компания-разработчик просто не получит прибыль. А вот если оно окажется вредным для здоровья,
расплачиваться будут люди — участники будущих исследований. Стремясь исключить возможность
таких неприятных сюрпризов, ученые еще на стадии доКИ тщательно ищут и выявляют все
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

нежелательные фармакодинамические свойства испытуемых веществ, анализируют эффекты, выявленные

в токсикологических исследованиях (о них мы говорим ниже), и изучают, как и почему они проявляются.
Если препарат подозревают в воздействии на какой-то определенный орган (сердце, мочеполовую или
нервную системы), его работу изучают более подробно, проводя дополнительные тесты, если это
требуется.

Во время исследования фармакодинамических взаимодействий определяют, как разные

вещества влияют на работу друг друга: например, лекарство для лечения диабета может
существенно изменять свойства противоопухолевого препарата.

А что насчет фармакокинетических исследований? Здесь ученые отслеживают судьбу

действующего вещества с момента попадания его в организм и до полного выведения
вещества и его метаболитов из организма. Для этого требуется определить биодоступность и
способность препарата усваиваться (т.е. попадать в организм, например, после приема
внутрь или нанесения на кожу); изучить его распределение в организме (в том числе узнать,
достигает ли вещество молекулы-мишени или органов, на которые оно может оказывать
токсический эффект); увидеть, как оно трансформируется и выводится.
Фармакокинетические тесты делятся на исследования абсорбции, распределения,
метаболизма, выведения и фармакокинетических лекарственных взаимодействий (табл. 2).
Первые четыре параметра часто сокращают до аббревиатуры ADME (absorption, distribution,
metabolism, and excretion). Роль фармакокинетики крайне велика, поскольку большинство
испытуемых веществ обычно плохо всасываются или плохо распределяются по организму.
Если планировать и проводить такие исследования грамотно, то можно отсечь значительное
количество молекул-кандидатов уже на этом этапе, что позволит расходовать больше
ресурсов на работу с действительно перспективными веществами.

Во время фармакологических испытаний животным вводят разные дозы препарата, а затем с

определенными интервалами берут кровь, мочу и другие биологические жидкости, чтобы
определить концентрацию в них лекарства и его метаболитов. Кроме того, нередко проводят
исследования с лекарствами, мечеными радиоактивным изотопом. Для этого к исследуемому
веществу добавляют радиоактивную метку и далее отслеживают его накопление в тех или
иных органах и системах организма. Это позволяет — с помощью радиографического
анализа — наглядно отследить, как быстро и сколько вещества попадает в организм, а также
как оно распределяется по организму, в том числе количественно охарактеризовать
преимущественное накопление в определенных органах и последующее выведение из них.
Полученные данные дают возможность, среди прочего, спрогнозировать, каким способом
стоит вводить препарат людям в КИ и через сколько времени он будет выводиться из
организма.

Общая и специфическая токсичности, токсикокинетика

Классификация токсикологических исследований также представлена в таблице 2. Они
делятся на исследования общих видов токсичности (то есть исследования, проводимые в
отношении всех лекарственных препаратов) и исследования специфических видов
токсичности. К общим видам токсичности относятся исследования общетоксических
свойств, генотоксичности, канцерогенности, а также онтогенетической и репродуктивной
токсичности (т.н. DART studies) (рис. 2).
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Рисунок 2. Исследования общих видов токсичности

Общетоксические свойства: что это такое и как их исследуют?

До первой фазы КИ должен быть проведен определенный минимум исследований

общетоксических свойств вещества-кандидата (они будут проводиться и дальше для
обоснования более длительного применения).

Длительность исследований общетоксических свойств определяется планируемой

продолжительностью применения препарата как в клинических исследованиях, так и после
регистрации. Например, если лекарство планируется применять лишь однократно
(диагностический контраст), то, как правило, достаточно исследования острой токсичности.
Если применение будет ограничено 10–14 дням (как в случае многих антибиотиков), то
обычно достаточно одномесячных исследований общетоксических свойств. Если лекарство
будет применяться длительно, то исследование общетоксических свойств ограничивается
шестью месяцами в случае грызунов и девятью месяцами в случае негрызунов (собак,
минипигов, нечеловекообразных приматов), поскольку это позволяет охватить большую
продолжительность их жизни, чтобы смочь наблюдать долгосрочную токсичность.

Различают два вида общетоксических тестов: определение острой

токсичности и токсичности повторных доз. Задача исследователей — выявить любые
негативные токсические реакции, вызванные введением вещества, и понять, как они
соотносятся с вводимой дозой. Проводя их, ученые предварительно отсекают молекулы,
токсичность которых заведомо неприемлема, а также выбирают диапазон токсических доз и
решают, какие животные подходят для исследования. При этом неприемлемая токсичность
— это компромиссная величина. Очевидно, что порог дозволенной токсичности средства от
рака будет выше, чем лекарства от простуды.

Острую токсичность определяют как минимум на двух разных видах животных, более того,
используют по крайней мере два способа введения токсических доз препарата: один из них
тот, который предполагается использовать в будущих КИ, второй — парентеральный
(инъекция). Если сведения об острой токсичности также можно получить, используя
результаты других тестов, отдельные испытания не проводят.

Для исследования токсичности повторных дозживотному дают препарат с интервалами в

течение определенного времени (оно зависит от предполагаемого режима приема ЛС для
людей) и отслеживают изменения в его организме и поведении. Внимательно следят за
изменением метаболизма и продолжительности жизни, за биохимическими показателями и
гистопатологией. Это помогает изучить токсическое воздействие вещества-кандидата на
органы-мишени, накопительный эффект потенциального лекарства, отсроченные побочные
эффекты (если предусмотрен период, когда вещество перестают вводить), а также их
обратимость.
В качестве примера доКИ, которое можно делать параллельно с КИ на добровольцах вплоть
до второй фазы, можно привести исследования генотоксичности, но и тут есть нюансы.
Изучение способности вещества вызывать изменения в генетическом материале in vitro с
использованием бактерий в качестве субъекта исследования (тест Эймса) должно быть
завершено только до начала I фазы КИ. Генотоксичность in vivo, в свою очередь, изучают
параллельно с исследованиями на здоровых добровольцах до начала II фазы. Некоторые
исключения могут быть сделаны, если в разработке находится препарат для детей,
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

исследования которого на взрослых не проводятся — тогда весь комплекс исследований

генотоксичности на животных придется завершить до начала исследований с участием
детей.

Любая специфическая токсичность исследуется только в том случае, когда это необходимо.
Например, если результаты изучения общей токсичности показали, что препарат может
вызывать нежелательные реакции со стороны кожи (или же предполагается его наружное
нанесение), нужно дополнительно исследовать фототоксичность — способность вещества
снижать устойчивость клеток кожи к неблагоприятному воздействию солнечных лучей (рис.
3).
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Рисунок 3. Исследования некоторых специфических видов токсичности

Отдельно стоит упомянуть токсикокинетические тесты, в ходе которых ученые определяют

системную концентрацию ЛС у животных, участвующих в доКИ безопасности, или, иными
словами, проводят оценку фармакокинетики вещества во время токсикологического
исследования. Токсикокинетика призвана бороться с риском перепутать отсутствие
токсичности с банальным недостижением у животных токсической концентрации
исследуемого вещества. Недостижение токсической концентрации может быть связано с
использованием животных разного пола, с путем введения вещества, его недостаточной
абсорбцией, выраженным метаболизмом, высокой иммуногенностью (в случае
биопрепарата) и другими факторами. Кроме того, токсикокинетика помогает удостовериться
в биодоступности вещества и дает возможность увидеть зависимость выраженности
токсических эффектов от содержания вещества-кандидата в организме. Этот анализ
необходим практически во всех случаях опорных токсикологических исследований in vivo, и
только после его завершения исследователи могут говорить о дозах вещества, которые
станут стартовыми в КИ.

Экологическая безопасность
Требования многих зарубежных стран предусматривают проведение испытаний с целью
подтвердить безопасность не только для человека, но и для окружающей среды в целом. Это
необходимо для оценки последствий попадания нового препарата в биосферу. В некоторых
случаях вред может быть значительным и требовать особых мер по утилизации.

Регламент и контроль доклинических

исследований
В соответствии с общемировыми требованиями опорные токсикологические исследования и
опорные исследования фармакологической безопасности (они входят в доКИ безопасности и
являются стандартным комплексом исследований для всех новых молекул, которые войдут в
состав лекарств) должны проводиться в соответствии с GLP. Все остальные
фармакологические исследования, а также пилотные токсикологические исследования, могут
проводиться без соответствия GLP, однако также должны быть хорошо стандартизированы,
чтобы давать валидные результаты. Но что такое GLP? Почему исследования безопасности
подвергаются дополнительному контролю? Какие еще есть ограничения и регламенты?

GLP расшифровывается как Good Laboratory Practice, или, по-русски, «Правила надлежащей
лабораторной практики». GLP определяютметодологию, уровень организации и проведения
доклинических исследований и применимы не только в доклинических исследованиях
потенциальных лекарственных препаратов, но и в разработке агрохимических,
косметических средств, пищевых добавок, а также медицинских изделий, контактирующих с
тканями человеческого организма. Международный стандарт, описывающий GLP,
называется OECD Principles on Good Laboratory Practice и призван обеспечить взаимное
признание результатов доКИ во всех странах-участницах OECD .

Некоторые компании, заинтересованные в проведении эффективных биомедицинских исследований, на

основе международных стандартов разрабатывают собственные методологии, которые, как правило,
содержат более широкие перечни требований. Примером может служить подход OECD+, который для
своих экспериментов in vitro и in vivo сформировала команда PMI Science. В его основе лежит совместное
 «ҚАЗАҚСТАН-РЕСЕЙ НУО «КАЗАХСТАНСКО-РОССИЙСКИЙ
МЕДИЦИНАЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ» МЕББМ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

применение стандартных методов токсикологической оценки и методов системной токсикологии,

созданных в компании.