Гематологические исследования

1
 Компоненты крови

Плазма крови (55%)

Лейкоциты и
тромбоциты (<1%)
Эритроциты (45%)

2
Общеклиническое исследование крови

• определение концентрации гемоглобина

• количество эритроцитов
• количество лейкоцитов
• скорость оседания эритроцитов (СОЭ)
• лейкоцитарная формула
• Гематокрит
• количество тромбоцитов

Дополнительно:
– время свертывания крови
– длительность кровотечения
– количество ретикулоцитов

3
 Гематологические анализаторы

Измеряемые Основные принципы

параметры измерения

 Гемоглобин Фотометрия

 Объем клеток
Кондуктометрия
 Количество клеток

6
 Эритроциты
Количество эритроцитов в
крови в норме:
12
Женщины - 3,5-5,0 ×10 /л
12
Мужчины - 4,2-5,6 ×10 /л
• Не содержат ни ядра, ни органелл
• Форма: двояковогнутый диск
• Диаметр: 7-8 мкм
• Функции: транспорт кислорода и
углекислого газа
• Продолжительность жизни: 120 дней
7
 Эритроциты
Показатели, характеризующие эритроцит:

• Средний объем эритроцитов (МСV): в норме-

80-100 fl (фемтолитров, или кубических
микрометров).
• Среднее содержание гемоглобина в эритроците
(MCH)
• Средняя концентрация гемоглобина в
эритроците (МСНС)
 Количество эритроцитов
• Показатель распределения эритроцитов по
в крови
объему (RDW)
В норме:
• Цветовой показатель: в норме ЦП= 0,85-1,05
Женщины - 3,5-5,0 ×1012 /л
• Морфологические характеристики
Мужчины - 4,2-5,6 ×1012 /л
эритроцитов
• Осмотическая резистентность эритроцитов

8
Определение показателей красной крови
на гематологическом анализаторе

9
 Показатели, характеризующие
тромбоцит:
•Количество тромбоцитов в крови:
в норме – 180 - 320 × 109/л
•МРV (mеаn platelet volume) -
среднее значение объема
измеренных тромбоцитов
в норме - 3,6 - 9,4 мкм3

по мере старения тромбоцитов их объем

уменьшается

10
Определение параметров тромбоцитов на
гематологическом анализаторе

11
 Лейкоциты
• Менее многочисленны по сравнению с эритроцитами и
тромбоцитами (в норме у взрослых: 4,0-8, 8 ×109/л )
• Имеют ядро
• Основной функцией лейкоцитов является защита
организма от чужеродных агентов

Субпопуляции лейкоцитов
Гранулоциты Агранулоциты
• Нейтрофилы
•Лимфоциты
• Эозинофилы
•Моноциты
• Базофилы

12
 Субпопуляции лейкоцитов
Нейтрофилы
•В норме у взрослых – 40 – 70 %
•Основная функция - защита организма от инфекций (главным
образом с помощью фагоцитоза)
•Длительность полупериода циркуляции в крови - 6,5 ч, затем они
мигрируют в ткани. Время жизни в тканях - от нескольких минут
до нескольких дней
40 
Эозинофилы
•В норме у взрослых – 1 – 5 %
•Фагоцитируют комплексы антиген-антитело, представленные
главным образом иммуноглобулином Е.
•После созревания в костном мозге около 3-4 часов находятся в
циркулирующей крови, а затем мигрируют в ткани.
Продолжительность их жизни в тканях - 8-12 дней
Эозинофилия при: аллергических заболеваниях (бронхиальная астма,
100  лекарственная аллергия), инвазии паразитов (аскаридоз, трихинеллез,
эхинококкоз, лямблиоз), онкологических заболеваниях
Базофилы
•В норме у взрослых – 0 –1 %
•Содержат гистамин
•Участвуют в воспалительных и аллергических реакциях, в
регуляции проницаемости сосудистой стенки
100  •Продолжительность жизни 8 -12 сут; время циркуляции в 13
периферической крови - несколько часов
14
 Субпопуляции лейкоцитов
Лимфоциты
• В норме у взрослых – 20 - 45%
• Диаметр – 7 – 9 мкм
В-лимфоцит • Основная функция - узнавание чужеродного антигена и участие
в адекватном иммунологическом ответе организма
• Продолжительность жизни – годы
Т-лимфоцит

Моноциты
• В норме у взрослых – 3-8 %
• Диаметр – 12 – 17 мкм
• После выхода из костного мозга циркулируют в крови 36 -104 ч,
затем мигрируют в ткани. В тканях дифференцируются в
макрофаги. Внесосудистый пул моноцитов в 25 раз превышает
циркулирующий.
• Основная функция макрофагов – фагоцитоз
• Продолжительность жизни макрофагов в тканях – годы
15
 Лейкоцитарная формула в норме
Процент от количества всех лейкоцитов
Клетки
при рождении взрослые
Миелоциты 0,5 -
Метамиелоциты 4 -
Нейтрофилы 27 1-5
палочкоядерные
Нейтрофилы 34 40-70
сегментоядерные
Лимфоциты 22,5 20-45
Моноциты 8 3-8
Эозинофилы 3 1-5
Базофилы 0,75 0-1
Плазмоциты 0,25 -
16
Определение параметров лейкоцитов
на гематологическом анализаторе

17
 Назначение гематологических
анализаторов
Гематологические анализаторы применяются для
диагностики болезнeй, как кроветворной системы,
так и всего организма человека,
и предназначены для скринингового анализа
в клинико-диагностических лабораториях

18
 Преимущества автоматического
анализа крови
• высокая производительность (30–100 и более проб в
час)

• высокая точность исследования (подсчет многих тысяч

клеток вместо сотни)
• небольшой объем крови (25–100 мкл)
• большое количество показателей (12–25 параметров)
вместо
10-12 при обычном анализе
• графическое представление распределения клеток
(гистограммы)
• повышение объективности исследований (минимум
вмешательства оператора)
19
 ОСНОВНЫЕ ЧАСТИ АНАЛИЗАТОРА

Гематологический анализатор состоит из трех основных частей:

 Гидросистема: Выполняет забор пробы, разведение,
смешивание, лизирование и промывку, создавая
регулируемые давление и вакуум, под действием которых
клетки крови проходят сквозь апертуру в процессе
подсчета.
 Система обработки данных: Подсчитывает, измеряет и
рассчитывает гематологические параметры, создает и
сохраняет результаты и гистограммы.
 Панель управления: Включает: ЖК-дисплей, клавиатуру,
параллельный (внешний принтер) и последовательный
(компьютер) интерфейсы.

20
 Весь ряд гематологических
анализаторов по виду выполняемых
исследований можно разделить
на четыре типа:
1)приборы, выполняющие анализ по небольшому числу
показателей, обычно по 6–8, и без дифференцирования
лейкоцитов на субпопуляции.
2)16-20-параметровые анализаторы, так называемые 3-
DIFF системы, способные дифференцировать
лейкоциты на три субпопуляции.
3)так называемые 5-DIFF системы, способные
дифференцировать лейкоциты по 5 популяциям
и позволяющие определять до 28 параметров.
4)анализаторы с модулем дифференцирования
ретикулоцитов. Общее количество параметров,
определяемых анализаторами с таким модулем доходит
до 40. 21
 Измеряемые параметры

Измеряемые
Принцип измерения
параметры

 Гемоглобин Фотометрия

 Объем клеток
Кондуктометрия
 Количество клеток

22
 Принцип измерения гемоглобина HGB
Гемоглобин (HGB) определяется в лизированном разведении. Реагент
лизирует эритроциты, при этом высвобождается гемоглобин.
Железо гемоглобина окисляется из двухвалентного (Fe2+) в
трехвалентное (Fe3+), формируя метгемоглобин, который реагирует с
цианидом калия (KCN) с образованием стабильного
цианметгемоглобина или гемоглобинцианида. Затем концентрация
гемоглобина (HGB) измеряется фотометрически.

23
Измерение гемоглобина

24
 Измерение параметров клеток крови

Существует два основных класса приборов для

измерения параметров клеток.
Приборы первого типа измеряют изменение
электрического сопротивления раствора в момент
прохождения форменного элемента крови через
апертуру.
Приборы второго типа при измерении
регистрируют отклонение световых лучей,
вызванные прохождением через них форменных
элементов крови.

25
 Метод измерения
Работа практически всех современных гематологических
анализаторов основана на кондуктометрическом методе,
разработанном братьями Coulter еще в 1949 г. С тех пор
он значительно усовершенствовался.
В последующих модификациях приборов добавлены
специальные дифференцирующие гемолитики, лазерное
светорассеяние, цитохимия и т.д.

26
Принцип кондуктометрического метода

27
 МЕТОД ИМПЕДАНСА
Метод импеданса заключается в
определении количества и размера клеток в
зависимости от изменения электрического
сопротивления, когда частица (клетка) в
токопроводящей жидкости проходит через
маленькую апертуру.

Каждая клетка при прохождении через апертуру – где существует

постоянный ток между внутренним и внешним электродами – вызывает
изменения импеданса проводящей суспензии клеток крови. Эти
изменения регистрируются как увеличение напряжения между
электродами.
Количество импульсов определяет количество клеток. Амплитуда
импульса пропорциональна объему клетки. Диаграмма распределения
клеток по объему называется гистограммой (WBC, RBC, PLT histograms).
Импульсы подсчитываются только в границах (заданных в фемтолитрах,
фл), которые находятся между заранее установленными нижним и
верхним пределами (дискриминаторами).
28
 Основные достоинства
кондуктометрических счетчиков частиц:

• высокая скорость счета и измерения частиц;

• хорошая воспроизводимость результатов;
• способность определять малые концентрации
частиц;
• малый объем пробы, необходимый для анализа;
• возможность регистрировать кривые
распределения по размерам;
• простота конструкции и обслуживания по
сравнению с приборами других типов.

29
 Недостатки кондуктометрических
счетчиков:

• Анализируемые частицы обязательно

должны находиться в жидком электролите,
проводимость которого известна.
• Проводимость же биологических жидкостей,
величина неопределенная и переменная,
зависящая от многих факторов.
• При подсчете микрочастиц
кондуктометрическим методом существуют
очень жесткие ограничения на диаметр
анализирующего отверстия, который должен
быть порядка размеров микрочастиц.

30
 Клетки крови

RBC, WBC, PLT,

Название
Red Blood Cell White Blood Cell Platelet

Другие названия Эритроциты Лейкоциты Тромбоциты

Зрелые клетки Неядерные

Ядра не имеют ядер
Ядерные
фрагменты

Популяция 4,5-5,5 млн/мкл 5-10.000/мкл 150-300.000/мкл

Полиморфноядерные клетки

RBC, NRBC (нейтрофилы, эозинофилы,

Субпопуляции (эритроциты и базофилы)
ядерные эритроциты)
Лимфоциты
Моноциты

NEU  13 мкм
EOS  16 мкм
Средний 7-8 мкм
BAS  14 мкм 2-4 мкм
диаметр толщина 1,8-2,0 мкм
LYM  8-15 мкм
MON 15-25 мкм

Средний объем 90 фл различный 12 фл 31

 Разведение: дилюент, гемолитик

3. Гемолитик
1. 2.

Кров WBC & HGB RBC & PLT

ь подготавливают два разведения проб крови.
Анализаторы
32
Аспирация и разведение проб:

33
 Блок-схема гемометра Коултера

РБ – разбавитель, ЛА – лизирующий агент, БТИ – блок тройного

измерения, ЭРЦ – эритроцит, ЛКЦ – лейкоцит, С – счетчик.
34
35
Основные реагенты для гематологических

анализаторов

 изотонический разбавитель (дилюент)

 лизирующий раствор (гемолитик)
 промывающий раствор и очищающий раствор

36
 Типы промывающих растворов

 растворы для мягкой промывки магистралей

анализатора между пробами
 растворы на основе гипохлорита натрия

37
Принцип работы оптического счетчика частиц

В момент пересечения луча клеткой происходит поглощение и

рассеяние света, которое обусловлено клеточным размером,
формой, плотностью, окрашиванием и гранулярностью
внутриклеточных структур 38
 Схема лазерной проточной цитометрии
PMT
4

Дихроичные
фильтры PMT
3
Поток
клеток
PMT
2
Фильтры с
полосой
PMT пропускания
1

Лазер

39
 ОПРЕДЕЛЕНИЕ И РАСЧЕТ ПАРАМЕТРОВ
Лейкоциты – WBC
(клеток/л, клеток/мкл)
Эритроциты – RBC
(клеток/л, клеток/мкл)
Концентрация гемоглобина –
HGB
(г/дл, г/л, ммоль/л)
Средний объем эритроцитов –
MCV (фл)
Гематокрит – HCT
(%, абсолютное значение)
Среднее содержание
гемоглобина в эритроците –
MCH (пг, фмоль)
Среднее концентрация
гемоглобина в эритроцитах –
MCHC (г/дл, г/л, моль/л)
Количество лейкоцитов.
WBC = WBCcal x (клеток/л или клеток/мкл)
Количество эритроцитов.
RBC = RBCcal x (клеток/л или клеток/мкл)
Фотометрическое измерение при 540 нм; в каждом
цикле выполняется измерение бланка по реагенту.
HGB = HGBcal x (HGBпробы – HGBblank)
Средний объем эритроцитов определяется по RBC-
гистограмме.
Рассчитывается по значениям RBC и MCV.
HCT (%) = RBC x MCV x 100,
HCT (абсолют.) = RBC x MCV
Рассчитывается по значениям RBC и HGB.
MCH = HGB / RBC
Рассчитывается по значениям HGB и HCT.
MCHC = HGB / HCT (абсолют.)
Единицы измерения отражаются в соответствии с
выбором единиц для результатов HGB (г/дл, г/л или
ммоль/л) 40
 ОПРЕДЕЛЕНИЕ И РАСЧЕТ ПАРАМЕТРОВ
Широта распределения
эритроцитов – RDW-SD и
Широта распределения
тромбоцитов – PDW-SD (фл)
Широта распределения
эритроцитов – RDW-CV и
Широта распределения
тромбоцитов – PDW-CV
(абсолют. значение)
Тромбоциты – PLT
(клеток/л, клеток/мкл)
Средний объем тромбоцитов –
MPV (фл)
Тромбокрит – PCT
(%, абсолютное значение)
Дифференцировка лейкоцитов:
• LYM, LY%: лимфоциты
• NEU, NEU%: нейтрофилы
• EOS, EOS %: эозинофилы
• BAS, BAS%: базофилы
• MON, MON%: моноциты
Широта распределения популяции эритроцитов и
тромбоцитов определяется по гистограмме по 20% пикам
xDW-SD = RDW cal x (P2 - P1) (fl),
xDW-CV = RDW cal x 0.56 x (P2 - P1) / (P2 + P1)
CV корригируется по фактору 0,56 к 60% выборке
Количество тромбоцитов
PLT = PLT cal x (клеток/л, клеток/мкл)
Определяется по PLT-гистограмме.
Рассчитывается по значениям PLT и MPV.
PCT (%) = PLT x MPV x 100,
PCT (абсолют.) = PLT x MPV
Абсолютные значения подсчитываются по каналам,
заданным по трем (пяти) дискриминаторам лейкоцитов
(WBC):
1.: RBC-LYM discriminator
2.: LYM-MID discriminator
3.: MID-GRA discriminator
Проценты рассчитываются по абсолютным значениям WBC.
41
42