REPONSES BIOTECHNOLOGIE 5EME ANNEE

1- Биообъекты как средство производства лекарственных средств.

БТ – направление научно-технического прогресса, использующее

биообъекты и биологические процессы в целях получения готовых
продуктов для целенаправленного воздействия на человека и окружающую
среду :
- Медицинское
- Продовольственное
- Аграрное
- Энергетическое
- Промышленное
- Экологическое
- Научное

Только БТ дает возможность получить лекарственные препараты.

 гормоны
 антибиотики
 незаменимые аминокислоты
 ферменты
 интерфероны
 интерлейкины

моноклональные антитела
Биопроцесс
- процесс, происходящий в живом организме, а также технология
производства биотехнологического продукта для последующего его
коммерческого использования.

1. Как начальный этап

Получение биомассы (культивирование клеток), например,
пробиотиков.

2. Как промежуточный этап.

Acetobacter oxydans D-сорбит L-сорбозу

3. Как заключительный этап.

фумаровая к-та аспартаза E.Coli (NH3) аспарагиновая к-та
2- Преимущества биотехнологических методов получения
аминокислот.
Синтез аминокислот
Процесс биотехнологического производства аминокислот включает
прямую мик-робную ферментацию, микробиологический или
ферментативный синтез из предше-ственников. В настоящее время
наиболее распространен микробиологический синтез аминокислот.
В промышленных масштабах аминокислоты получают либо экстракцией
из белко-вых гидролизатов, либо очисткой продуктов метаболизма
неспоролирующих грампо-ложительных почвенных бактерий,
например Corynebacterium или Brevibacterium spp.
Обычно для повышения их продуктивности используют мутагенез с
последующим от-бором штаммов - сверхпродуцентов определенных
аминокислот.
Альтернативным подходом является выделение и изменение генов,
кодирующих ключевые ферменты определенных биохимических реакций.
Таков, например, гено-инженерный способ получения аминокислоты
триптофана, синтезируемой Corynebacte-rium glutatamicum.Это
достигается введением в клетки дикого типа копии гена, кодирующего
атранилатсинтазу – фермент, лимитирующий синтез триптофана. Высокий
уровень биосинтеза триптофана достигается также введением в клетки C.
Glutatamicum модифицированных генов трех ключевых ферментов его
бисинтеза:
3-дезокси-Д-арабиногептулозанат-7-фосфатсинтазы, атранилатсинтазы и
атранилат-фосфорибозлтрансферазы. В качестве альтернативы для синтеза
аминокислот можно
использовать E. coli.
Изменение синтеза аминокислот осуществимо генетическими методами, в
том числе за счет использования мутантных организмов, таких, как
ауксотрофные и регуляторные мутунты. Промышленные штаммы как
правило, несут несколько мутаций, затрагивающих механизмы регуляции
целевой аминокслоты и ее предшественников.
Среди продуцентов аминокислот – различные микоорганизмы,
представители родов Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Aerobacter,
Microbacterium, Eschrichia. Для получения таких аминокислот, как L-
глутамат, L-валин, L-аланин, L-глутамин и L-пролин, возможно
применение природных штаммов и усиление у них продукции
аминокислот условиями ферментации. Например, высокий уровень
глутумата возможен при полном или частичном подавлении активности α-
кетоглуратдегидрогиназы, при добавлении в среду ПАВ и антибиотиков.

3- Факторы, влияющие на процесс ферментации.

На активность ферментов, а следовательно, и на скорость реакции

ферментативного катализа оказывают влияние различные факторы. К
числу основных относятся:
• концентрация и доступность субстрата;
• концентрация фермента;
• температура реакции;
• рН реакции;
• продолжительность процесса;
• наличие ингибиторов или активаторов.
В общем случае при низких концентрациях субстратов реакции
ферментации относятся к кинетическим реакциям нулевого порядка.
Участие ферментов в пищевых технологиях исчисляется минутами,
поэтому концентрации субстратов значительно превосходят концентрации
ферментов. Скорость большинства реакций ферментации соответствует
кинетическому уравнению первого порядка
dP/dT = k(S-P),
где dP/dT— скорость образования продукта, (S-P) — остаточная
концентрация субстрата в данный момент.

4- Преимущества использования иммобилизованных клеток.

Преимущества иммобилизованных ферментов:

1. Иммобилизованные ферменты, представляя собой

гетерогенные катализаторы, легко отделяются от

реакционной среды.
Это позволяет:
а) остановить в нужный момент реакцию;
б) использовать катализатор повторно;
в) получать продукт незагрязненный ферментом,
что особенно важно для пищевых и фарма-
цевтических производств
2. Иммобилизация способствует целенаправленному
изменению субстратной специфичности фермента,
зависимости его каталитической активности от рН,
ионного состава и других параметров среды
Преимущества иммобилизованных ферментов:
3. Во многих случаях иммобилизованные ферменты
характеризуются более высокой стабильностью по
отношению к денатурирующим воздействиям
Например, термоинактивация лактатдегидрогеназы,
иммобилизованной в 60%-м полиакриламидном геле,
происходящая при температуре 65°С, замедлена
в 3600 раз по сравнению с нативным ферментом.
4. Иммобилизация обеспечивает непрерывность
каталитического процесса, возможность регуляции
скорости катализируемой реакции, а также выхода
продукта
1. Отсутствие затрат на выделение и очистку
ферментов.
2. Снижение затрат на выделение и очистку
продуктов реакции
3. Возможность получения полиферментных
систем, осуществляющих многостадийные
непрерывно действующие процессы без
экзогенных кофакторов.
4. Более высокая активность и стабильность
5. Возможность поддержания
автоматизированных процессов

5- Факторы, указывающие на окончание процесса ферментации.

Факторы, влияющие на реакции ферментации На активность ферментов, а

следовательно, и на скорость реакции ферментативного катализа
оказывают влияние различные факторы. К числу основных относятся:
• концентрация и доступность субстрата;
• концентрация фермента;
• температура реакции;
• рН реакции;
• продолжительность процесса;
• наличие ингибиторов или активаторов.

В общем случае при низких концентрациях субстратов реакции

ферментации относятся к кинетическим реакциям нулевого порядка.
Участие ферментов в пищевых технологиях исчисляется минутами,
поэтому концентрации субстратов значительно превосходят концентрации
ферментов. Скорость большинства реакций ферментации соответствует
кинетическому уравнению первого порядка
- dP/dT = k(S-P), где dP/dT— скорость образования продукта, (S-P) —
остаточная концентрация субстрата в данный момент.
По окончании ферментации образуется сложная смесь, состоящая из
клеток продуцента, раствора непотребленных питательных компонентов и
накопившихся в среде продуктов биосинтеза. Такую смесь называют
культуральной жидкостью

6-Клетки, используемые при иммобилизации.

Для иммобилизации применяются различные

микроорганизмы:
Живые клетки - Клетки различной степени
поврежденности - если требуется провести многостадийный процесс
трансформации и биосинтеза и требуется не один а
несколько ферментов
Мертвые клетки -В них сохранились ферменты. Это ацетоновые
препараты
Клетки различной степени
Поврежденности- замороженные, высушенные, обработанные
органическими растворителями. Используются в одностадийных
процессах
7-Аппараты для культивирования биообъектов.
Ферментатор, его устройство. Совершенствование
биообъектов.

- биообъект – клетки растений

Источник углерода - глюкоза или

сахароза

Источник азота – аммониевые соли

неорганических кислот,

мочевина и смесь аминокислот.

Различные микроэлементы

Фитогормоны - ауксин, кинетин,

индолуксусная и гиббереллиновая
кислоты

Мочевина, смесь аминокислот

- биообъект - клетки животных

Источник углерода - глюкоза

Сбалансированнаясмесь минеральных веществ

Смесь аминокислот, пуриновые

и пиримидиновые основания

Смесь витаминов

Сыворотка крови

Ростовые вещества - инсулин, глюкагон,

простагландины, соматомедин С,

гидрокортизон, прогестерон, эстрадион,

тестостерон и другие

Небольшое количество антибиотиков во

избежание бактериального заражения

- Аппараты для приготовления

питательных сред

В лабораториях готовят в стаканах и колбах,

Стерилизуют в автоклавах

На производстве –

в специальных аппаратах

СМЕСИТЕЛЯХ – емкостные

аппараты с мешалками,

есть люк для сыпучих компонентов,

вентили для жидких компонентов,

Труба для подачи воздуха и пара –БАРБАТЕР

8-Ферментация - главная стадия биотехнологического

производства. Виды ферментаций. Технология получения
ферментов из животного сырья.

По времени протекания процесса можно выделить следующие виды

ферментации :
периодическая, периодическая подпиткой, объем-но-доливочная и
непрерывная
проводится определенное время.
После завершения полученный продукт выгружают, чистят
ферментер и далее процесс повторяется.
В зависимости от источника технология получения ферментных
препаратов имеет свои особенности. При извлечении ферментов из
растительного сырья и животных тканей технология сводится к экстракции
энзимов и очистке их от сопутствующих балластных веществ. Технология
ферментных препаратов микробного происхождения более сложная, так
как дополнительно включает этапы культивирования микроорганизмов –
продуцентов ферментов, в том числе этапы получения посевного
материала и производственной культуры соответствующего
микроорганизма.

Глубинный метод культивирования продуцентов ферментов. В этом

случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной среде.
Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно
значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это
вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата
перед его выделением.

9-Способы проведения глубинной ферментации.

Глубинная ферментация возможна в разных вариантах: периодическом с
подпиткой и непрерывном.
10-Технология получения ферментов из растительного сырья.

Технология производства ферментных препаратов из

растительного и животного сырья включает два основных этапа:
сбор ферментсодержащего сырья; выделение и очистка целевого
продукта.

В промышленных условиях ферменты из растительного сырья

получают в тропических и субтропических странах (папаин,
фицин, бромелаин).

Сбор сырья. При переработке мяса различных животных в самый

первый момент разделки туши производят сбор ферментного сырья

Консервирование сырья. Сырье немедленно консервируется с

использованием низких температур

Наибольшее распространение в производственных условиях

получила обработка низкими температурами и хранение органов и
тканей животных до момента переработки в замороженном
состоянии.

Широко используется метод обезвоживания измельченного сырья

при низких температурах ацетоном или этиловым спиртом.

Для получения технических препаратов допускается

консервирование животного сырья поваренной солью.

Из заготовленного на мясокомбинатах животного сырья, на

специальных заводах органопрепаратов получают ферментные
препараты различной степени очистки.

Измельчение сырья. В зависимости от вида используемого сырья

применяют различные методы измельчения и разрушения клеток.

Экстракция ферментов. Животные ткани, особенно поджелудочная

железа, содержат большое количество различных ферментов,
которые обладают различной растворимостью и стабильностью и
не могут быть экстрагированы из измельченного сырья по единой
технологической схеме.
При экстракции ферментов из животного сырья довольно часто
прибегают к подкислению экстрагента, что влечет за собой
торможение автолитических процессов.

11-Способы стерилизации термолабильных растворов на

биотехнологических производствах. Инсулин. Структура
молекулы.

Способы стерилизации сред

Периодическая стерилизация в биореакторе для выращивания

биообъекта – насыщенным водяным паром при температуре 125-1300С и
охлаждение
Непрерывная стерилизация – на УНС насыщенным водяным паром при
температуре 125-1300С

Инсулин. Структура молекулы.

12-Установка непрерывной стерилизации (УНС).
Аппараты, входящие в установку. Методы получения
инсулина.

УНС - установка непрерывной стерилизации ;

1. Нагреватель - паром в специальных колонках или теплообменниках

2. Выдерживатель – емкостные аппараты или трубы в виде спиралей
3. Охладитель – теплообменники «пластинчатые» или «труба в трубе»

Аппараты, входящие в установку ;

Методы получения инсулина ;

-Из поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней

экстракционным методом.
-Химический синтез (170 химических реакций)
-Синтетико-ферментативный. Ферментативным путем проводилась замена
остатка аланина на
треонин (превращение инсулина свиньи в инсулин человека).
-Биосинтетический с использованием рекомбинантных ДНК (через
проинсулин, синтезом отдельных цепей и их сшивки).
13-Непрерывный способ стерилизации питательных сред.

установка непрерывной стерилизации

Состоит:

1. Нагреватель - паром в специальных колонках или теплообменниках

2. Выдерживатель – емкостные аппараты или трубы в виде спиралей

3. Охладитель – теплообменники

«пластинчатые» или «труба в трубе»

14-Отбор клеток после трансформации, содержащих
рекомбинантную ДНК.

Работа по созданию химерных биообъектов

(содержащих рекомбинантную ДНК), включает 4
основных этапа:

1. Получение нужного гена

2. Его встраивание в генетический элемент

(вектор), способный к репликации

3. Введение гена в состав вектора, в

организм-реципиент

4. Идентификация (скрининг и селекция)

клеток, которые приобрели желаемый ген
Получение генов

- выделение гена из ДНК

- синтез гена химико-ферментативным путем

- воссоздание гена на основе изолированной

матричной РНК
15-Периодический способ стерилизации питательных сред.

Периодическая стерилизация в биореакторе для выращивания

биообъекта
– насыщенным водяным паром при температуре 125-1300С и
охлаждение
_ Непрерывная стерилизация – на УНС насыщенным водяным
паром при температуре 125-1300С

16-Получение генно-инженерного инсулина.

Методы получения инсулина

1) Из поджелудочной железы крупного рогатого

скота и свиней экстракционным методом.

2) Химический синтез (170 химических реакций)

3) Синтетико-ферментативный. Ферментативным
путем проводилась замена остатка аланина на
треонин (превращение инсулина свиньи в
инсулин человека).
4) Биосинтетический с использованием
рекомбинантных ДНК (через проинсулин,
синтезом отдельных цепей и их сшивки).

Исторически первым способом получения инсулина

для терапевтических целей является выделение
аналогов этого гормона из природных источников
(островков поджелудочной железы крупного
рогатого скота и свиней).

17-Аппараты для приготовления питательных сред, устройство

аппараты, технология приготовления сред.
 Mediap Mediap Mediap Mediapr Mediapr Mediapr Mediapr
Модель
rep-10 rep-20 rep-30 ep-45 ep-65 ep-90 ep-120

Объем
приготовляе
0,5-10 4-20 6-30 9-45 13-65 18-90 25-120
мой среды,
л.
Внутренний съемны съемны съемны
съемный съемный съемный съемный
сосуд й й й
Микропроце
ссорное + + + + + + +
управление
Программы + + + + + + +
Цветно Цветно Цветно
Цветной Цветной Цветной Цветной
й й й
Дисплей сенсорн сенсорн сенсорн сенсорн
сенсорн сенсорн сенсорн
ый ый ый ый
ый ый ый
Принтер + + + + + + +
Мешалка
+ + + + + + +
магнитная
Скорость
мешалки, 0-260 0-260 0-260 0-260 0-260 0-260 0-260
об/мин
Температура
стерилизаци 60-138 60-138 60-138 60-138 60-138 60-138 60-138
и, °С
Время
стерилизаци 60-120 60-120 60-120 60-120 60-120 60-120 60-120
и, мин
Температура
30-75 30-75 30-75 30-75 30-75 30-75 30-75
розлива, °С
Порт для
+ + + + + + +
добавок
Блокировка
+ + + + + + +
крышки
Интерфейс
+ + + + + + +
RS232
Потребляем
ая
3,6 8,0 10,0 20,0 20,0 20,0 20,0
мощность,
кВт
Габариты
550×65 550×65 550×65 550×775 550×775 550×775 650×895
(Ш×Г×В),
5×530 5×765 5×965 ×1000 ×1130 ×1130 ×1160
мм

 Микропроцессорное управление поддерживает заданные параметры

(температуру приготовления, стерилизации и розлива среды, скорость
перемешивания) , что гарантирует высокое качество приготовленной
среды.
 Полный цикл приготовления и стерилизации среды занимает от 60 до
120 минут.
 Специальный порт для внесения добавок (витаминов, антибиотиков,
крови) в готовую среду до разлива.
Продолжительность стерилизации среды регулируется от 1 до 99 минут.
 Температура автоклавирования регулируется в диапазоне от 60°С до
138°С.
 Встроенная магнитная мешалка с регулируемой скоростью от 0 до 260
об/мин обеспечивает постоянное перемешивание и однородность в течение
всего цикла приготовления и розлива среды.
 Быстрое охлаждение циркулирующей холодной водой до выбранной
температуры розлива готовой среды. Поддержание заданной температуры
среды в течение всего цикла розлива.

Техника приготовления основных питательных сред :

Для культивирования микробов в лабораторных условиях готовят

питательные среды с учетом потребности в питательных веществах
каждого вида в отдельности. Питательная среда в своем составе должна
содержать углерод, водород, кислород, азот, фосфор, серу, магний, железо,
микроэлементы и биостимуляторы роста.

Различают питательные среды естественные(молоко, яйца, картофель и т.

п.),искусственные,приготовленные из продуктов животного или
растительного происхождения, исинтетические(среды Чапека, Сабуро).
По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными.
18-Этапы создания рекомбинантных ДНК.
1. Рестриктазное расщепление ДНК, вырезание необходимого фрагмента
ДНК (гена) из исходной ДНК организма-донора. Можно так же
синтезировать нужный ген.
2. Определение точных границ гена.
3. Обработка рестиктазами вектора для клонирования, который будет
реплицироваться в клетке хозяина (плазмида, бактериофаг).
4. Сшивание лигазой двух фрагментов ДНК с образованием
рекомбинантной ДНК.
5. Введение рекомбинантной ДНК клетку-хозяина. Этот процесс
называется трансформацией.
6. Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК.
7. Получение специфичного белка, синтезированного
трансформированными клетками хозяина.
19-Особенности сред для культивирования клеток животных.
Клетки животных во многом отличаются от прокариотических и грибных
клеток: они медленнее растут, у них большая чувствительность к ранению
и пузырькам воздуха. Эти свойства клеток оказывают влияние на
конструкцию биореакторов и ферментеров, в особенности системы
перемешивания и аэрации

Перемешивание должно быть гомогенным, чтобы избежать градиентов

температуры и рН, повышенных концентраций субстрата и продуктов. При
этом необходимо учитывать чувствительность клеток к ранению. Обычно
перемешивание осуществляется большими лопастными мешалками при
низких скоростях.

Для предотвращения пенообразования и повреждения клеток пузырьками

воздуха можно уменьшить объем подаваемой газовой смеси, использовать
поверхностную продувку или безпузырьковую аэрацию через мембраны.
При сокращении объема подаваемого газа необходимо увеличить в нем
концентрацию кислорода.

Выращивание животных клеток можно осуществлять в стационарной

(batch), стационарной с подпиткой (fed- batch) или непрерывной (continuous)
культуре с задержанием биомассы или без. При стационарном
культивировании клетки растут без добавления субстрата после посева
культуры.
Из-за низкой продуктивности, связанной с медленным ростом, для клеток
животных предпочтителен непрерывный процесс культивирования с
задержанием клеток (перфузионная система). Это приводит к большей
плотности культуры клеток и большему контакту с ними среды, что
увеличивает продуктивность.

Многие клетки млекопитающих растут только будучи прикрепленными к

поверхности.

20-Получение инсулина через синтез отдельных цепей.

Искусственно синтезируется ген цепи А и ген цепи В по

известной их аминокислотной последовательности.

Чтобы осуществить перенос генов цепи А и цепи В в клетку

Е.coli их соединяют с плазмидой.

Гены встраиваются через метионин к концу гена, кодирующего

фермент β – галактозидазу.

Плазмиды встраиваются в клетки Е.coli.

Бактерии выращивают на среде с галактозой. При этом

индуцируется синтез β – галактозидазы, а вместе с ней А и В
цепей инсулина.

Бактерии лизируют и обрабатывают бромцианом, который

специфически расщепляет белки по остатку метионина.

Цепи инсулина отделяют от β – галактозидазы.

Очистка цепей и их объединение in vitro.

21-Особенности сред для культивирования клеток растений.

Питательные среды для культивирования клеток растений

Питательная среда – основной фактор
успешного культивирования изолированных органов, тканей и клеток
растений. Основными компо- нентами питательных сред являются
минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углеводного
питания (сахароза), вита- мины и регуляторы роста (фитогормоны)

22-Преимущества использования иммобилизованных

ферментов перед нативными. Особенности сред для
культивирования микроорганизмов.

Преимущества использования иммобилизованных ферментов перед

нативными.
Особенности сред для культивирования микроорганизмов.

Преимущества иммобилизованных ферментов ;

1. Иммобилизованный фермент легко отделить от реакционной среды, что

дает возможность:
-остановить в нужный момент реакцию
-использовать фермент повторно
-получать продукт не загрязненный ферментом
2. Использование иммобилизованных ферментов позволяет проводить
процесс непрерывно и
регулировать скорость катализируемой реакции.
3.Иммобилизация способствует целенаправленному изменению свойств
катализатора в том числе его спецефичности, стабилизации по отношению
к различного рода денатурирующим воздействиям .
Основные условия проведения процесса культивирования ;

-Асептичность процесса
-Оптимальная температура
-Оптимальное значение рН
-Обеспечение культуры кислородом
-Недопущение вспенивания

23-Методы получение аминокислот.

1.Гидролиз Белков

Наиболее Старый Способ - Белки Подвергаются Щелочному,

Кислотному, Ферментативному Гидролизу.

В Качестве Гидролизуемого Сырья Используются Отходы Мясной

Промышленности, Куриный Бклок, Казеин Молока, Кровь, Растительные
Материалы.

Недостатки:

Дефицит Исходного Сырья И Высокая Себестоимость

Требуется Многоступенчатая Химическая Обработка Гидролизатов

При Кислотном Гидролизе Часть Аминокислот Разрушается

При Ферментативном Гидролизе С Освобождением Аминокислот Фермент

Может Распадаться И Гидролиз Будет Не Полным

2.Химический Способ

Достаточно Эффективен.

Недостатки: Процесс Многоступенчатый И Требует Сложного

Аппаратурного Оформления, Получается Рецемическая Форма
Аминокислот
(Смесь L- И D-Форм)
3.Химико-Энзиматический Метод

В Результате Химических Реакций Получают

Предшевственники Аминокислот, Затем Проводят
Трансформацию С Помощью Ферментных Систем
Соответствующих Штаммов Микроорганизмов.

Недостатки:

-Дорогой, Т.К. Требует Дорогих Исходных Субстратов И Ферментов.

4.Микробиологический Метод ( Прямой Или

Многоступенчатый)

Перспективный И Экономически Выгодный Способ.

Непосредственно Синтезируются L-Аминокислоты.

24- Типовая схема получения биотехнологического продукта.

25- Достоинства и недостатки E. coli как клетки-реципиента

E. coli играет важную роль в современной промышленной микробиологии

и биологической инженерии. Работа Стенли Нормана Коэна и Герберта
Бойера на E. coli с использованием плазмид и эндонуклеаз рестрикции для
создания рекомбинантной ДНК находится у истоков современной
биотехнологии.
Кишечную палочку считают универсальным организмом для синтеза
чужеродных белков В E. coli исследователи вводят гены при помощи
плазмид, что позволяет осуществлять биосинтез белков для
промышленной ферментации. Также разработаны системы для синтеза в E.
coli рекомбинантных белков. Одним из первых примеров использования
технологии рекомбинантных ДНК является синтез аналога инсулина
человека. Модифицированные E. coli используют при разработке вакцин,
синтеза иммобилизованных ферментов и решения других задач. Однако в
организме E. coli невозможно получать некоторые крупные белковые
комплексы, содержащие дисульфидные связи, в частности, белки, для
проявления биологической активности которых требуется
посттрансляционная модификация

Гены кишечной палочки также используются для генетической

модификации растений, в частности из нее выделяют ген устойчивости к
антибиотикам неомицину и канамицину.

26 - Основные этапы развития биотехнологии.

Этапы Развития Биотехнологии ;

- Основные научные достижения послепастеровского этапа ;

1856 - чешский монах Г. Мендель открыл законы доминирования
признаков и ввел понятие единицы наследственности в виде дискретного
фактора, который передается от родителей потомкам;
1869 - Ф. Милер выделил «нуклеин» (ДНК) из лейкоцитов;
1883 - И. Мечников разработал теорию клеточного иммунитета;
1884 - Ф. Леффлер изолировал и культивировал возбудителя дифтерии
1892 - Д.Ивановский открыл вирусы;
1893 - В. Оствальд установил каталитическую функцию ферментов;
1902 - Г. Хаберланд показал возможность культивирования клеток
растений в питательных растворах;
1912 - Ц. Нейберг раскрыл механизм процессов брожения;
1913 - Л. Михаэлис и М. Ментен разработали кинетику ферментативных
реакций;
1926 - X. Морган сформулировал хромосомную теорию наследственности;
1928 - Ф. Гриффит описал явление «трансформации» у бактерий;
1932 - М. Кнолль и Э. Руска изобрели электронный микроскоп.
1941 – 1960 гг - Эра антибиотиков – Характеризуется открытием и
началом промышленного производства пенициллина и других
антибиотиков путем глубинной ферментации микроорганизмов
1961 – 1975 гг. Этап управляемого биосинтеза – Ознаменовался
получением антибиотиков, ферментов, аминокислот и др. метаболитов с
помощью мутантных штаммов, проведением регулируемой
фермент

27- Получение инсулина через проинсулин.

Синтез инсулина через проинсулин ;

- Используется штамм JM -109 со встроенной в плазмиду

нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей
гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и
присоединенного к его N-концу через остаток метионина
фрагмента белка А Staphylococcus aureus.

- Плазмида содержит ген устойчивости к

- β–лактамным антибиотикам.

- Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli.

- Для культивирования используются простые по составу

питательные среды. После наращивания основного количества
биомассы в среду вносят специальный индуктор для
переключения на синтез рекомбинантного белка.

- Время ферментации 12 часов.

28 -Факторы, указывающие на окончание процесса ферментации.

Клетки, используемые при иммобилизации

Основные показатели, характеризующие

окончание процесса ферментации

- прекращение синтеза целевого продукта

(пробы в конце ферментации отбирают
каждый час, чтобы установить, что прироста
активности продукта не происходит)

- исчерпание углерода и азота из среды

- незначительное повышение рН среды (лизис клеток)

Окончание процесса ферментации ;

- Жидкость, которая образуется в процессе

ферментации, называется – КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ЖИДКОСТЬ

- Культуральная жидкость содержит клетки

продуцентов, остатки питательных веществ,
продукты метаболизма, один из которых
самый главный – ЦЕЛЕВОЙ ПРОДУКТ

Иммобилизованные клетки ;

Для иммобилизации применяются различные

микроорганизмы:

- Живые клетки - если требуется провести многостадийный процесс

трансформации и биосинтеза и требуется не один а
несколько ферментов

- Мертвые клетки - В них сохранились ферменты. Это ацетоновые

препараты

- Клетки различной степени Поврежденности - замороженные,

высушенные, обработанные
органическими растворителями.
Используются в одностадийных процессах

29 -Биотехнология как наука. Биообъекты.

Биотехнология – наука ; изучающая

методы получения полезных для
человека веществ и продуктов в
управляемых условиях с использованием
микроорганизмов, клеток растений и
животных или изолированных из клеток
биологических структур (ферментов)

биообъекты ;

1. микробная клетка

2.ткани и клетки растений

3.ткани и клетки животных

4.ферменты

30 -Химические методы иммобилизации ферментов.

Иммобилизация фермента-включение его в какую либо

изолированную фазу, кот. отделена от фазы свободного раствора,
но способна обмениваться с последней молекулами субстрата.

Способы иммобилизации ;

-Физические методы
-Химические методы :

- Путем ковалентного сшивания с

полимерным носителем

- Путем поперечного сшивания

ковалентными связями молекул
фермента без носителя

31 - Особенности культивирования животных клеток.

Культивирования микроорганизмов ;

-Поверхностное культивирование
- Глубинное культивирование

Культивирование клеток растений ;

- Каллусное культивирование
- Суспензионное культивирование
Культивирования клеток животных ;

- клеток животных
Основные условия проведения процесса культивирования ;

-Асептичность процесса
-Оптимальная температура
-Оптимальное значение рН
-Обеспечение культуры кислородом
-Недопущение вспенивания

32- Физические методы иммобилизации ферментов.

Иммобилизация фермента-включение его в какую либо

изолированную фазу, кот. отделена от фазы свободного раствора,
но способна обмениваться с последней молекулами субстрата.

Способы иммобилизации :

-Химические методы
-Физические методы :
 - Адсорбционные
- Механические :

 Включение в гель
 Микрокапсулирование
 Включение в волокна
 Включение в липосом, Включение в жидкие мембран
33 -Принципиальная схема выделения и очистки БАВ.

34 -Методы получения ферментов микробиологическим синтезом.

производство ферментов микробиологическим синтезом может

осуществляться ;
1. Глубинным культивированием

2. Поверхностным культивированием

-В качестве продуцентов ферментов используются –

микроскопические грибы, бактерии, дрожжи.

-В промышленном производстве ферментов

используются

-плесневые грибы рода Aspergillus

-бактерии рода Bacillus

35- Ферментация - главная стадия биотехнологического

производства.
Виды ферментаций.
Требования, предъявляемые к продуцентам ферментов.

Ферментация – главная стадия биотехнологического процесса ;

Любой процесс выращивания биообъекта в

питательной среде называется культивированием
или ферментацией.

Виды ферментации ;

– поверхностная (культивирование на поверхности

плотных и жидких питательных сред)

- Глубинная (культивирование во всем объеме

жидкой питательной среды

Требования, предъявляемые к продуцентам ферментов ;

-Должны синтезировать в больших количествах

преимущественно один фермент и минимум -
других
-Не должны продуцировать аллергенные и
токсические субстанции

-Хорошо развиваться в крупномасштабных

ферментаторах

36- Источники получения ферментов.

Источники получения ферментов ;

1. Растения :

2. органы животных :
3.микроорганизмы :

37-Методы получение аминокислот.

способы получения аминокислот ;

1.гидролиз белков

- наиболее старый способ - белки подвергаются щелочному,

кислотному, ферментативному гидролизу.

- в качестве гидролизуемого сырья используются отходы мясной

промышленности, куриный бклок, казеин молока, кровь, растительные
материалы.

недостатки:
-дефицит исходного сырья и высокая себестоимость
-требуется многоступенчатая химическая обработка гидролизатов
-при кислотном гидролизе часть аминокислот разрушается
-при ферментативном гидролизе с освобождением аминокислот фермент
-может распадаться и гидролиз будет не полным
2.химический способ

- достаточно эффективен.

недостатки:
-процесс многоступенчатый и требует сложного
аппаратурного оформления, получается рецемическая форма аминокислот
(смесь l- и d-форм)

3.химико-энзиматический метод

- в результате химических реакций получают

предшевственники аминокислот, затем проводят
трансформацию с помощью ферментных систем
соответствующих штаммов микроорганизмов.

недостатки:
-дорогой, т.к. требует дорогих исходных субстратов и ферментов.

4.микробиологический метод ( прямой или многоступенчатый)

- перспективный и экономически выгодный способ.

непосредственно синтезируются l-аминокислоты.

38 - Источники получения ферментов.

Meme question numéro ( 35-Источники получения ферментов. )

39 - Способы иммобилизация клеток.

Иммобилизованные клетки ;

Для иммобилизации применяются различные

микроорганизмы:

- Живые клетки - если требуется провести многостадийный процесс

трансформации и биосинтеза и требуется не один а несколько
ферментов
 - Мертвые клетки - В них сохранились ферменты. Это ацетоновые
препараты

- Клетки различной степени поврежденности - замороженные,

высушенные, обработанные органическими растворителями.
Используются в одностадийных процессах

40 -Биообъекты как средство производства лекарственных средств.

Для реализации биотехнологических процессов важными параметрами

биообъектов являются: чистота, скорость размножения клеток и
репродукции вирусных частиц, активность и стабильность биомолекул или
биосистем.

Следует иметь в виду, что при создании благоприятных условий для

избранного биообъекта биотехнологии эти же условия могут оказаться
благоприятными, Представителями контаминирующей микрофлоры
являются вирусы, бактерии и грибы, находящиеся в культурах
растительных или животных клеток.

Активность и стабильность в активном состоянии биообъектов - одни из

важнейших показателей их пригодности для длительного использования в
биотехнологии

Классификация биообъектов ;

1) Макромолекулы
2) Микроорганизмы
3) Макроорганизмы
41 - Преимущества использования иммобилизованных клеток.

Биокаталитическая активность целых

иммобилизованных клеток в настоящее время может
быть использована в различных отраслях науки и
техники:

-при биосинтезе и трансформации таких соединений, как

аминокислоты, органические кислоты, антибиотики,
стероиды углеводы, углеводороды, нуклеотиды и
нуклеозиды;

-в пивоварении и виноделии;

-при очистке сточных и природных вод;

-при извлечении металлов из сточных вод;

-при ассимиляции солнечной энергии;

-при изготовлении водородных солнечных элементов;

-в азотфиксации;

-в аналитических целях при изготовлении электродов.

42 -Типовая схема получения биотехнологического продукта.

43 -Физические методы иммобилизации ферментов.

Meme question numero 31-Физические методы иммобилизации ферментов.

44 -Особенности поверхностного культивирования продуцентов

ферментов (питательные среды, условия культивирования).

Поверхностный способ культивирования ферментов ;

-В основе лежит выращивание микроорганизмов на

твердых, рыхлых питательных средах

-Питательная среда – пшеничные отруби, древесные

опилки ( солодовые ростки, овсяную шелуху), минеральные
источники азота и фосфора, различные питательные
вещества (в зависимости от получаемого фермента)

-Стерилизация питательной среды – острым паром при

105-140 С в течение 60-90 минут.

-Температура культиврования – 38-40С

-Процесс выращивания длится -36-48 часов

Поверхностный способ культивирования ;

-Высушенная культура гриба (содержит остатки питательной

среды и мицелия) представляет собой товарный препарат
марки – ПХ

-После экстракции и упаривания (содержание сухих веществ -

50 %) получают ферментный препарат
марки – П2Х

-При высушивании концентрата в распылительной

-сушилке получают ферментный препарат

марки - П3Х

45 - Аппараты для культивирования биообъектов.

Ферментатор, его устройство.
Способы проведения глубинной ферментации.

Аппараты для приготовления питательных сред ;

-В лабораториях готовят в стаканах и колбах, Стерилизуют в автоклавах

-На производстве – в специальных аппаратах СМЕСИТЕЛЯХ – емкостные

- аппараты с мешалками, есть люк для сыпучих компонентов, вентили для

жидких компонентов, Труба для подачи воздуха и пара – БАРБАТЕР

Способы проведения глубинной ферментации ;

-Периодическая – в аппарат подают стерильную

питательную среду и посевной материал. Выращивают в оптимальных
условиях определенное время, после чего процесс останавливают.
Содержимое аппарата отправляют на выделение целевого продукта.
- Непрерывная - в аппарат подают стерильную питательную среду и
посевной материал. Выращивают в оптимальных условиях определенное
время, а затем в аппарат непрерывно подают стерильную питательную
среду, а из аппарата непрерывно вытекает жидкость на
выделение целевого продукта

- Регулируемая ферментация - в аппарат подают стерильную питательную

среду и посевной материал. Выращивают в оптимальных условиях
определенное
время, а затем при необходимости дозируют (добавляют) определенные
стерильные компоненты питательной среды, в которых нуждается
биообъект в
этот период (определяет микробиолог) Такая ферментация получила
название – полупериодическая

46 - Носители для иммобилизации ферментов