АМИНОКИСЛОТЫ, ВИТАМИНЫ И

КОФЕРМЕНТЫ, ПОЛУЧАЕМЫЕ В
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
БИОИНЖЕНЕРНЫМИ МЕТОДАМИ
• Аминокислоты широко применяют в медицине для терапии по слеоперационных больных,
при лечении заболеваний ЦНС, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки,
печени. Помимо этого – в качестве пищевых добавок, биодобавок (БАДов), приправ и
усилителей вкуса, аминокислоты используются также как сырье в химической,
парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве других веществ.
• Витамины – это низкомолекулярные органические вещества, способные в очень низких
концентрациях оказывать сильное и разнообразное действие. Природным источником
многих витаминов являются растения и микроорганизмы. Микробиологическим путем
получают некоторые витамины группы B, а также эргостерин и каротин, являющиеся,
соответственно, предшественниками витаминов D2 и провитамина A. В процессе
химического синтеза L-аскорбиновой кислоты (витамина С) используют одну
микробиологическую стадию.
Многие ферментативные реакции включают перенос электронов
или групп атомов с одного субстрата на другой. В таких реакциях
всегда принимают участие вспомогательные соединения –
коферменты, которые выполняют функцию промежуточных
переносчиков атомов или функциональных групп. Ферменты
обычно высокоспецифичны к своим субстратам, коферменты же
взаимодействуют со многими ферментами, обладающими
различной субстратной специфичность
 • Микробиологический метод получения аминокислот, наиболее распространенный в настоящее
время, основан на способности микроорганизмов синтезировать все L-аминокислоты, а в
определенных условиях – обеспечивать их сверхсинтез. Биосинтез аминокислот в микробных
клетках протекает в виде так называемых свободных аминокислот, или «пула аминокислот», из
которого в процессах конструктивного метаболизма синтезируются клеточные макромолекулы. Для
синтеза всех белков требуется 20 аминокислот.
• Пути синтеза большинства аминокислот взаимосвязаны. При этом одни аминокислоты являются
предшественниками для биосинтеза других. Пируват является предшественником аланина, валина,
лейцина; 3-фосфоглицерат – серина, глицина, цистеина; щавелевоуксусная кислота – аспартата,
аспарагина, метионина, лизина, треонина, изолейцина; α-кетоглутаровая кислота – глутамата,
глутамина, аргинина, пролина; фосфоэнолпируват+эритрозо-4-фосфат – фенилаланина, тирозина,
триптофана; 5-фосфорибозил-1-пирофосфат + АТФ – гистидина. Синтез каждой аминокислоты в
микробных клетках реализуется в строго определенных количествах, обеспечивающих образование
последующих аминокислот, и находится под строгим генетическим контролем. Контроль
осуществляется по принципу репрессии и ретроингибирования. Данный механизм контроля
исключает перепроизводство аминокислот, а также препятствует их выделению из клеток в
окружающую среду.
 Чтобы добиться сверхсинтеза отдельных аминокислот, возможны два пути: обойти или
изменить данный контрольный механизм их синтеза. Для первого пути возможно
использование природных «диких» штаммов; очень существенны при этом условия
ферментации, так как добиться дисбаланса в системе синтеза аминокислот можно путем
изменения ряда основных факторов среды (концентрация основного субстрата, рН,
соотношение макро- и микроэлементов в среде и др.). Изменение контрольного механизма
синтеза аминокислот осуществляется генетическими методами. Штаммы продуцентов
улучшают генетическими методами, выделяя ауксотрофные мутанты и мутанты с измененными
регуляторными свойствами. При этом получают мутантные организмы: ауксотрофные и
регуляторные мутанты. Ауксотрофные мутанты – это организмы, утратившие способность к
синтезу одной или нескольких аминокислот, бактерии, которые под влиянием мутагенных
факторов (облучение, химическое воздействие и др.), утратили способность самостоятельно
синтезировать какую-либо необходимую для роста и развития аминокислоту, а с другой
стороны, – приобрели способность к сверхсинтезу другой аминокислоты.
• В последние годы для получения новых эффективных штаммов – продуцентов
аминокислот – стали применять новейшие методы биотехнологии. Методы
генетической инженерии позволяют повышать количество генов биосинтеза путем
их клонирования на плазмидах. Это приводит к увеличению количества ферментов,
ответственных за 52 синтез аминокислот, следовательно, повышает выход целевого
продукта. Клонирование генов системы синтеза аминокислот в клетки
микроорганизмов с иным, по сравнению с донорским организмом, типом питания
позволяет расширять сырьевую базу и заменять дорогостоящие сахаросодержащие
субстраты более дешевыми.
• Среди продуцентов аминокислот – различные микроорганизмы, представители родов
Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Aerobacter, Microbacterium, Escherichia.
Промышленные штаммы, как правило, несут несколько мутаций, затрагивающих
механизмы регуляции целевой аминокислоты и ее предшественников.
• Производственные биотехнологические процессы получения аминокислот реализуются в
условиях глубинной аэробной периодической ферментации. Скорость синтеза аминокислот не
совпадает во времени со скоростью роста производственной культуры. Максимальная продукция
аминокислоты наступает, как правило, когда прирост биомассы практически прекращается.
Поэтому питательная среда на первом этапе ферментации должна обеспечивать
сбалансированный рост клеток, а на втором – условия для сверхсинтеза целевой аминокислоты.
В качестве источника углерода и энергии используют богатые сахаросодержащие субстраты,
главным образом, мелассу. Возможно также привлечение более доступных субстратов (ацетат,
сульфитный щелок, углеводороды). В зависимости от таксономического положения и
физиологических потребностей микроорганизмов в качестве источника азота используют соли
аммония, нитраты, а также аминокислоты и молекулярный азот. В состав среды вносят
необходимые количества углерода и азота, фосфатов и других солей, а также стимуляторы роста
(витамины, дрожжевой экстракт), ПАВ, антибиотики.
• Периодический режим ферментации и богатая по составу среда требуют соблюдения строгой
стерильности в ходе получения инокулята и на ферментационной стадии. Стерилизации
подвергаются питательная среда, воздух и все технологическое оборудование. После стадии
ферментации в процессе обработки культуральной жидкости клетки отделяют от раствора,
который далее подвергают очистке от окрашенных примесей и взвешенных частиц с помощью
сорбционных методов. Далее процесс проводится с использованием различных методов
выделения и очистки в зависимости от сферы применения конечного продукта. Для
фармацевтической и пищевой промышленности аминокислоты выпускают в виде высушенных
чистых кристал- 53 лических препаратов; для кормовых и технических целей используют
Витамин В12 – альфа-(5,6-диметилбензимидазолил) кобамид цианид – стимулятор
эритро- и лейкопоэза. Биологический синтез является единственным способом его
получения. Способность к синтезу данного витамина широко распространена среди
прокариотических микроорганизмов. Активно продуцируют витамин В12
Propionibacterium, а также Pseudomonas и смешанные культуры метанообразующих
бактерий. Некоторые мутантные штаммы пропионовых бактерий способны
продуцировать свыше 50 мг витамина В12 на 1 л среды, а в присутствии его
предшественника 5,6-диметилбензимидазола (5,6-ДМБ) – накапливать до 200 мг на
1 л культуральной жидкости. Культивируют продуценты витамина В12 на средах,
приготовленных из пищевого сырья (кукурузный и мясной экстракты, соевая и
рыбная мука). В настоящее время успешно ведется поиск активных продуцентов,
образующих достаточное количество витамина на средах из непищевого сырья,
когда в качестве источника углерода и энергии используются изопропиловый спирт,
метанол и др.
 Пропионовые бактерии выращивают периодическим методом в анаэробных условиях
на среде, содержащей кроме пищевого сырья глюкозу, соли кобальта и сульфат
аммония. В процессе ферментации образуются кислоты, которые затем нейтрализуют,
непрерывно подавая в ферментёр раствор щелочи. Через 72 ч после начала
ферментации в питательную среду вносят предшественник (5,6-ДМБ), так как без него
вместо витамина В12 синтезируются фактор В (кобинамид) и не обладающий
терапевтическим эффектом псевдовитамин В12, у которого азотистым основанием
служит аденин. Общее время ферментации – 6 сут. По ее окончании витамин В12
остается в клетках бактерий, т.е. в биомассе, которую далее сепарируют, а целевой
продукт экстрагируют подкисленной водой. Для предотвращения образования
коферментной формы витамина В12 в качестве стабилизатора добавляют нитрит
натрия. Далее следуют стандартные стадии выделения и очистки. Полученный продукт
используется для изготовления разных лекарственных форм препарата и в
производстве поливитаминных препаратов.
 Важных для человека форм витамина D две: D2 (эргокальциферол) и D3
(холекальциферол). Первый попадает в наш 54 организм только с пищей, а
второй мы не только получаем из еды, но можем синтезировать сами под
воздействием солнца. Проходя через печень, обе формы превращаются в
25-гидроксивитамин D (сокращённо он обозначается 25(HO)D).
Физиологическая активность обоих витаминов (D2 и D3) равноценна.
Витамины D – это группа родственных соединений, в основе которых
находится эргостерин, который обнаружен в клеточных мембранах
эукариот. Содержание эргостерина в дрожжевых клетках колеблется в
пределах 0,2 – 11 %. Трансформация эргостерина в витамин D2
происходит под влиянием ультрафиолетового облучения. Эргостерин
является исходным продуктом для получения витаминов D, а также ряда
стероидных гормонов, пищевых и лекарственных препаратов
В промышленности эргостерин получают, используя дрожжи Sacch. cerevisiae, Sacch.
carlsbergensis, а также мицелиальные грибы. Засев производят большим количеством
инокулята. Культивирование ведут при высокой температуре и сильной аэрации в среде,
содержащей большой избыток источников углерода по отношению к источникам азота.
Важное условие синтеза эргостерина дрожжами – хорошая аэрация. В анаэробных
условиях в клетках дрожжей накапливается предшественник эргостерина – сквален.
Показано, что кислород индуцирует синтез стеринов, оказывая активирующее влияние на
эпоксидазу сквалена, – первого фермента биосинтетического пути. Индукция синтеза
эргостерина начинается при 0,03 % содержании О2 в газовой фазе и достигает максимума
при 2 % концентрации. Для биосинтеза стеринов дрожжами важно, чтобы среда
содержала большой избыток углеводов и мало азота. Дрожжи, богатые белком, как
правило, содержат мало стеринов. Эти данные касаются главным образом пекарских
дрожжей. В случае дрожжей рода Candida высокое соотношение C/N в среде приводит к
накоплению липидов, а не эргостерина.
 Для получения кристаллического витамина D2 дрожжи или мицелий грибов подвергают
гидролизу раствором соляной кислоты при 110 °С. Гидролизованную массу обрабатывают
спиртом при 75-78 °С и после охлаждения до 10 – 15 °С фильтруют. Фильтрат упаривают до
содержания в нем 50 % сухих веществ и используют как концентрат витаминов группы В.
Витамин D2 получают из массы, оставшейся после фильтрации. Массу промывают, сушат,
размельчают 55 и дважды обрабатывают при 78 °С трехкратным объемом спирта. Спиртовые
экстракты сгущают до 70 % содержания сухих веществ. Таким образом получают липидный
концентрат. Его омыляют раствором NaOH, а стерины остаются в неомыленной фракции.
Кристаллы эргостерина выпадают из раствора при 0 °С. Очистку кристаллов проводят путем
перекристаллизации, последовательным промыванием 69%-ным спиртом, смесью спирта и
бензола (80:20) и повторной перекристаллизацией. Полученные кристаллы эргостерина сушат,
растворяют в эфире, облучают УФ светом, после чего эфир отгоняют, а раствор витамина
концентрируют и кристаллизуют. Для получения масляного концентрата раствор витамина
после фильтрации разбавляют маслом до стандартного уровня. Данный препарат используют в
медицинских целях.