Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
пробоподготовки
q0
R% 100
q B qo
где q0 и qB — количество вещества в органической и водной фазах.
Принимая во внимание, что q = СV (V — объем фазы), можно найти зависимость между D
и R с учетом вышеприведенной формулы:
C0V0 D
R% 100
C0VB C0V0 D
Методы ТФЭ
В целом, все методы твердофазной экстракции (Solid-Phase Extraction, SPE) можно
разделить на две группы: он-лайн и офф-лайн ТФЭ (on-line SPE, off-line SPE).
В офф-лайн методах стадии пробоподготовки и идентификации аналитов
аппаратурно разделены; поэтому подготовленная проба может быть сохранена и
позже проанализирована несколькими различными аналитическими методами.
В он-лайн методах концентрирующий картридж с сорбентом напрямую соединен с
аналитической колонкой жидкостного хроматографа; в этом случае проба не
выделяется, а сразу анализируется методом ВЭЖХ. Соответствующий он-лайн
метод существует и для газовой хроматографии - это метод твердофазной
микроэкстракции ТФМЭ (Solid-Phase Microextraction, SPME). Он значительно
отличается от обычного метода ТФЭ и может быть приравнен к статической
разновидности сорбционных методов.
Твердофазная экстракция
Картриджи
Картриджи-патроны являются основным форматом, применяемым в SPE (ТФЭ). Патрон
обычно состоит из инертной полиэтиленовой или полипропиленовой оболочки, внутри
которой помещается сорбент, плотно и равномерно упакованный между двумя пористыми
фильтрами. В зависимости от свойств определяемых компонентов, их количества и
концентрации, а также свойств раствора матрицы, может быть выбран один или несколько
последовательно соединенных патронов с одинаковыми или различными сорбентами. В
трудных случаях приходится разбивать процесс ТФЭ-очистки на ряд подэтапов, причем на
каждом из них применяют свои характерные пары патрон-элюент, выполняющие
специфические задачи, например, предварительная очистка, концентрирование, тонкая
очистка, фракционирование целевых компонентов и т.д.
Основными видами являются тубус шприца и тип патрона. SPE картридж представляет
собой маленькие пластиковые или стеклянные открытые контейнеры стандартно
упакованных адсорбционными материалами (сорбентами) различных типов и адсорбционных
характеристик. Патронный тип по-прежнему самый популярный формат, обычно упакован 40-
60 мкм упаковочным материалом. Ограничения упаковки SPE обычных картриджей включают
ограничения скорости потока и закупорки верхней фритты при обработке содержащимися в
воде суспендированными твердыми частицами, такими как в поверхностных или сточных
водах. Таким образом, типичный объем образца составляет 500 мл, если образец не был
тщательно предварительно отфильтрован. В случае с фильтрованным образцом объем может
быть выше. SPE картриджи доступны в широком диапазоне размеров, с объемом от 1 мл до
50 мл. При выборе оптимального размера картриджа для конкретного применения,
необходимо учитывать следующие факторы : способность сохранять все аналиты, объем
исходного образца, и конечный объем очищенного элюата.
Твердофазная экстракция
Адсорбционная очистка
Анализируемая проба по возможности должна содержать как можно меньше
компонентов матрицы образца, могущих помешать определению целевых аналитов или
загрязнить узлы применяемой для анализа аппаратуры. Адсорбционная очистка пробы
имеет целью быстрое и эффективное удаление мешающих веществ матрицы при
помощи различных адсорбционных материалов.
Адсорбционная очистка может происходить без перевода аналитов в фазу сорбента; в
этом случае процедура очистки не приводит к концентрированию целевых аналитов,
которые остаются в жидкой фазе, тогда как примеси сорбируются и удаляются.
В другом методе адсорбционной очистки на первом этапе проводят концентрирование
аналитов на твердой фазе с последующим смывом примесей на второй стадии, и по
возможности более селективным смывом аналитов на третьей. Фактически, этот способ
адсорбционной очистки активно использует твердофазную экстракцию; в зарубежной
печати этот подход называется SPE cleanup, что можно перевести как «очистка с
применением ТФЭ». В сущности, любая процедура ТФЭ сопровождается некоторой
очисткой пробы, т. к. из образца удаляются соединения, не удерживаемые
адсорбционным материалом, к примеру, неорганические соли.
ПРИМЕНЕНИЕ ТФЭ
Экстракция растворителями, обычно
требующая множества трудовых затрат, при
автоматизации выполняется за считанные
минуты, с уменьшеннием затрат
растворителей и времени на подготовку
образцов при использовании систем
ускоренной экстракции растворителями
(ASE®) или систем для ТФЭ (AutoTrace®).
Системы ASE используют запатентованную
технологию экстракции из твердых и
полутвердых образцов, используя обычные
растворители при повышенной температуре
и давлении.
Твердофазная экстракция
Полимерные сорбенты
Матрица образца Масса сорбента
Кровь, сыворотка, плазма 30 мг сорбента на 250 мкл
Моча 30 мг сорбента на 1 мл
Фильтраты гомогенатов тканей 60 мг сорбента на 100 мг ткани
Режим Рекомендуемый
Образец Растворитель Полярность
разделения сорбент (Phenomenex)
слабо
нейтральный нормально-фазовый Si-1, NH2
полярный
органический
растворитель
органическое нейтральный полярный нормально-фазовый CN, Si-1, FL-PR, NH2
соединение
Низкоспецифичные сорбенты
Из водных сред
• Выделение нейтральных и ионизирующихся аналитов из водных растворов. Слабых кислот и
оснований ионным подавлением. Сильных кислот и оснований с использованием экстракции
ионных пар.
Примеры применения
Изоляция агро- и индустриальных химикатов из поверхностных вод с использованием C18,
углерода или полистирол- дивинилбензола (PS-DVB)
Выделение лекарственных средств из биожидкостей с использованием С18, С8, PS-DVB или
цианопропила (CN)
Выделение макромолекул из биожидкостей и продуктов брожения с использованием C4
Выделение пигментов и красителей из напитков и экстрактов продуктов питания с
использованием C18
Изоляция из биосред углеводов и нуклеозидов с использованием AMINO
Выделение белков, пептидов и поверхностно-активных веществ с использованием DIOL
Из органических растворителей
Изоляция полярных пестицидов из жиров и масел с использованием цианопропила (CN)
Изоляция полициклических ароматических соединений из жидкого топлива с
использованием AMINO
Определение активных ингредиентов в мазях и суппозиториях с использованием DIOL
Твердофазная экстракция
Ионообменные сорбенты
• В основном сильные ионообменники предназначены для извлечения аналитов
(кислот/оснований) .
• Избирательное извлечение аналитов за счет манипулирования с рН и ионной силой
образца .
• Для извлечения биологических макромолекул с неизмененной активностью на
сорбентах, базирующихся на целлюлозе, декстране, агарозе .
Примеры применения
Извлечение карбокси, сульфо и фосфорных кислот, фенолов, аминов и неорганических
ионов из воды
Извлечение аминокислот, органических кислот, нуклеозидов и нуклеотидов из
биологических жидкостей
Извлечение органических кислот и оснований из синтетических топлив
Извлечение органических кислот, фенолов и аминов из вин, фруктовых соков и
пищевых экстрактов.
Твердофазная экстракция
Решаемые задачи для различных типов сорбентов
Сорбенты Применение
Лекарственные препараты в сыворотке, плазме и моче
С18 Органические кислоты в вине
Следовые количества пестицидов в воде
Графитизированные сажи Следовые количества полярных пестицидов в воде
Полимерные сорбенты Экстракция полярных метаболитов лекарственных средств
(ПС-ДВБ)
Лекарственные препараты в сыворотке, плазме и моче
C8
Пептиды в сыворотке и плазме
Экстракция неполярных или умереннополярных аналитов из неводных растворов
Силикагель
Классификация липидов
Экстракция неполярных или умереннополярных аналитов из неводных растворов
Флоризил Пестициды в пищевых продуктах
Полихлорированые бифенилы в трансформаторном масле
Оксид алюминия A Экстракция гидрофильных аналитов из неводных растворов
Извлечение катионных аналитов из водных и неводных растворов
Катионообменник
Фракционирование основных белков и ферментов
Извлечение анионных аналитов из водных и неводных растворов
Анионообменник
Экстракция кислых или слабокислых белков и ферментов
Бифункциональные Экстракция основных и амфотерных лек.средств из сыворотки,плазмы и мочи
Лек.препараты и метаболиты в биологических жидкостях
Аминопропильные NH2
Фракционирование нефти и масел
Цианопропильные CN Лек.препараты и метаболиты в биологических жидкостях
Диол ОН Лек.препараты и метаболиты в биологических жидкостях
Твердофазная экстракция
Для начала разработки метода может быть проведен быстрый обзор библиографических
источников, опубликованных ведущими производителями компонентов для ТФЭ, где
разнообразие типа образца частично объясняет, почему имеется двадцать или больше
вариантов извлечения аналита, разработаных для одного и того же вещества. Это особенно
касается таких соединений как лекарственные препараты и агрохимикаты, для которых
может не быть исследований различных матриц. Важно отметить, что матрица варьируется
от чистого соединения в форме дозы или коммерческого продукта до остаточных количеств
в жидкостях организма, растениях, сточных водах, почвах и т.д ; каждый пример отражает
различные концентрации целевого вещества в присутствии сильно отличающейся и
мешающей матрицы.
Твердофазная экстракция
6-chloro-N2-ethyl-N4-isopropyl-1,3,5-triazine-2,4-diamine
Твердофазная экстракция
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ И РАСТИТЕЛЬНЫЕ
ПРЕПАРАТЫ
Анализ фармацевтических продуктов осложняется очень высоким уровнем содержания
компонентов матрицы, которые присутствуют в качестве наполнителей в препарате. Такие
соединения включают связующие, наполнители, глазирующие агенты и регуляторы
растворения таблеток, а также основы, используемые при приготовлении сиропов,
эликсиров, кремов и паст. Это становится очевидным, что в то время как
концентрирование активных веществ до анализа требуется очень редко, а вот удаление
некоторые форм матрицы необходимо гораздо чаще. В случаях, когда в образце
растворитель должен быть заменен на другой для проведения анализа, например, в
случаях экстракции соединений из водных препаратов, которые будут подвергаться
анализу методами ГХ или ГХ/МС, то лучше адаптировать метод таким образом , чтобы
целевой аналит сохранился а другие компоненты матрицы - устранены. В тех случаях,
когда растворитель образца совместим с используемым в аналитическом методе, то
сохранение примесей матрицы и отделения целевого аналита является сравнительно
простым вариантом. Более сложной задачей является разработка методологии ТФЭ для
извлечения активных веществ из кремов и гелей. Многие основы для подготовки кремов и
гелей, выбираются, руководствуясь такими факторами, как растворимость в воде,
буферной емкостью, рН, проницаемостью кожи, и другими механическими свойствами.
Твердофазная экстракция
Образцы матриц
Вода (сточная, речная, др.) Забуферить до соответствующего рН , отфильтровать твердые частицы из образца.
Соединения с полярностью
от низкой до умеренной Лек.препараты, Соединения с полярностью от Анионный обмен: кислые
(или неполярные) умеренной до высокой Ионизированные / заряженные аналиты
Свойства аналитов пестициды, Пестициды
Гидрофобные (нейтрализованые / соединения Катионный обмен:
гербициды
нейтрализованные/ незаряженные) Основные лек.препараты
незаряженные
Вода, Неполярные органические Гексан, хлороформ, Водные; с низкой ионной силой Биологические жидкости
Водный, разбавленый растворители или умеренно петролейный эфир,
Проба/матрица биологические буферы (<30 mM), с
буфером полярные органические толуол или хлористый + буфер
жидкости скорректированным pH
растворители метилен
1. Кондиционирование -
1. Сольватация полярными 1. Сольватация полярными полярными органическими
органическими органическими растворителями растворителями 1. Метанол
Шаг растворителями 1. Метанолl 2. Уравновешивание 1. Метанол (oбычно) 2. Уравновешивание- 2. 25 mM Tрис-ацетат,
кондиционирования 2. Вода или буфер 2. Гексан или хлороформ
2. Уравновешивание водой растворителем матрицы или Буферами с низкой ионной pH 7
или буфером образца силой, и с скорректированным
pH
Анионный обмен:
Неполярные органические 1.буфер pH 7;
Водные буферы с растворители с небольшим Гексан с 1 % ТГФ, Водные буферов с низкой 2.Метанол (50:50)
добавлением от 5 до 50% Метанол: Вода
Шаг промывки количеством модификаторов (1 этилацетат, ацетон, концентрацией соли или без Катионный обмен:
полярных органических (5:95) до 5%) с полярностью от ацетонитрил или ИПС органических растворителей 1. Буфер pH 6
растворителей
умеренной до низкой 2. 1 M уксусная кислота
3. Метанол
Другой схемой, получившей наибольшее распространение (см. рис. 1). является вариант,
когда первая колонка (ТФЭ патрон) устанавливается на шестиходовом двухпозиционном
переключающем клапане таким образом, что в первом положении она оказывается между
насосом 1 и сливом, а во втором - между насосом 2 и второй колонкой, которая, в свою
очередь, подключена к детектору. Эта схема осуществляет ту же задачу, что и первая, с той
лишь разницей, что элюирование посторонних малоудерживаемых веществ с первой колонки
осуществляется первой подвижной фазой, подаваемой первым насосом высокого давления.
Непосредственно перед выходом с первой колонки целевых веществ клапан переключают и
на ее вход поступает вторая подвижная фаза со второго насоса высокого давления,
элюирующая эти вещества на вторую колонку для продолжения хроматографи ческого
разделения. Обычно вторая подвижная фаза - значительно более сильный элюент. чем
первая, по отношению к целевым веществам на первой колонке, а размеры второй колонки
значительно превосходят размеры первой, но это вовсе не обязательно. После выхода
последнего из целевых веществ с первой колонки клапан можно снова переключить в первое
положение и отсечь, таким образом, те нежелательные вещества пробы, которые иначе
вышли бы со второй колонки значительно позже, увеличив обшее время анализа.
Подобная схема может быть реализована как в режиме ТФЭ с относительно "грязной"
пробой и низкоэффективным патроном, так и для улучшения избирательности ВЭЖХ анализа с
заколом пробы, уже прошедшей предварительную экстракцию, с использованием только
высокоэффективных колонок.
Он-лайн ТФЭ
Он-лайн ТФЭ
В последнее время появилось много новых, пригодных для ввода весьма "грязных" проб, в
том числе и биологических. Это и так называемые сорбенты с ограниченным доступом в поры
(RAM) и с молекулярным импринтингом (МІР), и колонки с турбулентным потоком. Общая
трудность - отсутствие хороших автосамплеров для ввода подобных проб, обеспечивающих
низкий уровень последовательного загрязнения (белки, например, способствуют сорбции многих
целевых веществ на игле, а смыть их непросто).
Другая сложность связана с тем, что число заколов, которые можно выполнить без смены
патрона, обычно исчисляется лишь десятками, редко достигая одной-двух сотен, что не всегда
достаточно для лабораторий, занимающихся анализами на потоке. Да и степень очистки от
посторонних примесей в этом режиме не всегда достаточна для получения хорошей
хроматограммы на выходе второй колонки. В этом случае рассматриваемая схема может
оказаться важным подспорьем для более полного отделения примесей уже после
предварительно проведенной грубой экстракции. При этом обе колонки могут быть наполнены
высокоэффективным сорбентом с размером частиц 5 или 3 мкм. В качестве первой колонки
весьма удобно использовать короткие и относительно дешевые предколонки длиной 10-20 мм и
диаметром от 2 до 4.6 мм.
Стоит отметить, что применение этой схемы отнюдь не ограничивается лишь обращенно-
фазным вариантом, она прекрасно работает и в нормальной фазе. В некоторых случаях
возможно также объединение обращенно-фазной или ионообменной хроматографии на первой
колонке с разделением по механизму с полярными взаимодействиями (HILIC) на второй.
Он-лайн ТФЭ
Обычно для этих целей применяется градиент, но. как уже говорилось, после градиента
требуется время на уравновешивание. Допустим, есть два близких по свойствам
сравнительно полярных вещества и одно малополярное. Для разделения первых двух
требуется длинная колонка, но третье в той же подвижной фазе выйдет с нее очень не
скоро. Данная схема позволяет элюировать с первой колонки на вторую эти два еше не
разделенных вещества, переключить клапан, поместив первую колонку с третьим
веществом после второй, и продолжить разделение. При правильном подборе колонок и
подвижной фазы третий пик выйдет первым на детектор, пройдя только через первую
колонку, а первые два успешно поделятся, пройдя последовательно через первую, вторую и
снова первую колонку. Таким образом можно оптимизировать многие градиентные
хроматографические разделения, сократив время анализа, по меньшей мере, вдвое.
На основе этих базовых схем переключения колонок можно создавать более сложные, с
использованием двух клапанов, позволяющие, например, комбинировать принцип
"хроматограф и ческой лупы" с опережающим противоточным смывом
сильноудерживаемых примесей с первой из трех колонок.
Он-лайн ТФЭ
МИКОТОКСИНЫ : АФЛАТОКСИН В1
ТФЭ патроны «ДИАПАК».
А). Предварительная очистка и концентрирование пробы
Водно-ацетонитрильный экстракт (25 мл) наносят на патрон ДИАПАК А-3 со скорость 2–3
капли в секунду, отбирают 20 мл элюата и разбавляют его равным количеством дважды
дистиллированной воды. Тщательно перемешанный раствор наносят на патрон ДИАПАК П-3 со
скоростью не более 1 капли в секунду, после чего промывают патрон 5 мл воды и осушают
воздухом в течение 1 мин. Элюируют целевую фракцию АЗ последовательным прокачиванием 7
мл ацетонитрила, 7 мл смеси бензол/ацетонитрил (1:2 по об.) и 7 мл смеси бензол/ацетонитрил
(1:1 по об.) со скоростью не более 1 капли в секунду в приемную колбу. Пропускают элюат через 10
г безводного сульфата натрия (двух-трехсантиметровый слой на ватном тампоне в конической
воронке) самотеком в отгонную сердцевидную колбу. Ополаскивают приемник 2 мл произвольно
подобранной смеси бензол-ацетонитрил и пропускают элюат через осушитель, затем
промывают осушитель 3 мл той же смеси и присоединяют ее к элюату. Упаривают досуха на
роторном испарителе при температуре не выше 40º С и сразу же перерастворяют в 0,5 мл бензола.
ПЕСТИЦИДЫ : ХОП
ТФЭ патроны «ДИАПАК».
А). Предварительная очистка экстракта ХОП на патроне ДИАПАК А-3
Наносят на патрон 25 мл экстракта ХОП, а затем патрон промывают 2–3 мл смеси
вода/ацетонитрил (16:84 по об.) со скоростью скапывания 2–3 капли в секунду, собирая
элюат А в мерную пробирку до объема 25 мл.
Б). Концентрирование фракции ХОП на патроне ДИАПАК П-3
К элюату А добавляют 5 мл дважды дистиллированной воды, перемешивают и наносят
полученный раствор на подготовленный патрон со скоростью скапывания 1–2 капли в
секунду, а затем патрон промывают 5 мл дважды дистиллированной воды. Смывы
отбрасывают. Патрон высушивают в течение 1 мин с помощью водоструйного насоса.
Элюируют фракцию ХОП последовательно 5 мл ацетона и 5 мл смеси
дихлорметан/ацетон (1:1 по об.) в приемник с 15 г безводного сульфата натрия, добавляют
10 мл сухого гексана, перемешивают и выдерживают 15 мин. Отфильтровывают элюат в
отгонную колбу через осушитель (3–5 г безводного сульфата натрия в пластиковом корпусе
воронки), дважды промывают остаток в приемнике 3 мл гексана, пропускают через тот же
осушитель и упаривают объединенные фильтраты на роторном испарителе при
температуре не выше 35º С до объема около 0,5 мл.
Некоторые примеры использования ТФЭ
Метод ТФЭ допинговых препаратов на патронах типа CLEAN SCREEN (ZSDAU020 or ZCDAU020
бифункциональный силикагельный сорбент содержащий привитую С18 и ионобменные группы
бензолсульфоната)
1. Подготовка образца
Моча:
a. К 5 мл мочи добавить 50–300 мкл 1.0 M уксусной кислоты для доведения рН 4.8 - 5.5.
Кровь:
a. К 2 мл крови добавить 8 мл деионизированной воды. Перемешать и оставить на 5 минут.
b. Добавить 150–300 мкл 1.0 M уксусной кислоты для доведения рН 4.8 - 5.5.
c. Центрифугировать 10 минут при 670 g и отделить надосадочную жидкость.
Tкани:
a. Гомогенизировать 1 часть ткани с 3 частями деионизированной воды.
b. Центрифугировать 10 минут при 670 g и отделить надосадочную жидкость.
c. Перенести 10 мл супернатанта в чистую пробирку.
d. Добавить 50–300 мкл 1.0 M уксусной кислоты для доведения рН 4.8 - 5.5
2. Кондиционировать патрон CLEAN SCREEN.
a. 1 × 3 мл CH3OH; продуть воздухом.
b. 1 × 3 мл деионизированной воды;отбросить.
c. 1 × 1 мл 0.1 M уксусной кислоты; отбросить.