Вы находитесь на странице: 1из 3

ТЕХНОЛОГИИ И МЕТОДЫ

Выбор метода для определения


концентрации холестерина липопротеидов
высокой плотности
М.Г. Творогова
Российский кардиологический научно-производственный комплекс, Москва

многочисленные методические подходы [2, 15].


В статье кратко описаны достоинства и недостатки Препаративное выделение при последовательном
многочисленных методов, используемых в практике для ультрацентрифугировании в солевых растворах
определения ХС ЛПВП. Рассмотрены основные группы различных плотностей, соответствующих границам
новых прямых или гомогенных методов определения ХС гидратированной плотности выделяемых ЛП, поз-
ЛПВП. Отмечено, что несовпадение значений ХС ЛПВП, воляет изолировать ЛПВП и определить их состав.
полученные разными методами, в основном обусловле- Длительность и трудоемкость ультрацентрифуги-
но двумя причинами: способом выделения ЛПВП и осо- рования привела к разработке методов, более дос-
бенностями строения и состава частиц ЛПВП пациента. тупных для лабораторной практики. Для выделения
ЛПВП в клинических лабораториях были разрабо-

М
ногочисленные проспективные эпиде- таны преципитационные методы, которые выпол-
миологические исследования показали няются в несколько этапов. Первый — осаждение
достоверную и независимую отрицатель- ЛП, содержащих апоВ, при использовании преци-
ную взаимосвязь между уровнем холестерина липо- питирующих агентов, второй — центрифугирова-
протеидов высокой плотности (ХС ЛПВП) и часто- ние для разделения осадка и надосадочной жидко-
той ишемической болезни сердца [10]. В этой связи сти (супернатанта), третий — определение ХС в су-
при разработке программ по первичной и вторич- пернатанте — ХС ЛПВП.
ной профилактике ИБС уделяется особое внимание Исследования доказали идентичность концент-
уровню ХС ЛПВП пациента. В докладе Националь- рации ХС во фракции ЛПВП, выделенной ультра-
ной образовательной программы по холестерину центрифугированием или преципитационными
(США) уровень ХС ЛПВП < 40 мг/дл назван факто- методами с использованием различных агентов
ром риска ИБС, а уровень ХС ЛПВП ≥ 60 мг/дл — (полиэтиленгликоль, декстран-сульфат, фосфо-
отрицательным фактором риска [8]. В докладе Ев- вольфрамовая кислота и др.), за исключением сме-
ропейского общества по изучению атеросклероза си гепарин:хлористый марганец [7, 12]. Последний
концентрация ХС ЛПВП < 1,0 ммоль/л считается метод не позволял полностью преципитировать
маркером увеличения риска ИБС [17]. Определение апоВ, особенно при высоком уровне триглицеридов
ХС ЛПВП, наряду с определением ХС и триглице- в крови. Определение специфичности при преци-
ридов, рекомендовано проводить всему населению, питации ЛП, содержащих апо В, смесью фосфо-
начиная с 20-летних, по меньшей мере один раз в вольфрамовой кислоты и хлористого магния пока-
5 лет. зало, что в супернатанте присутствуют 95% радио-
Липопротеиды высокой плотности впервые активно меченого апоА-I и практически отсутствует
идентифицированы как отдельный класс ЛП при апоВ [5]. Тем не менее, этапы выделения ЛПВП ме-
аналитическом ультрацентрифугировании плазмы тодом преципитации (осаждение, центрифугирова-
крови [9]. За последние десятилетия определен ли- ние) препятствуют полной автоматизации процесса
пидный и белковый состав ЛПВП, получено множе- и способствуют увеличению аналитической вариа-
ство экспериментальных данных о возможных ме- бельности.
ханизмах антиатерогенной роли ЛПВП. Эти сведе- В настоящее время разработаны «прямые» или
ния подробно рассмотрены нами ранее [3, 4]. гомогенные методы определения ХС ЛПВП. В ходе
В клинической биохимии уровень ЛПВП в таких методов изоляция других классов ЛП не тре-
плазме крови обычно оценивают по содержанию в бует дополнительных операций, и концентрацию
них ХС. Для выделения ЛП можно использовать ХС ЛПВП можно определить напрямую в сыворот-

ЛАБОРАТОРНАЯ МЕДИЦИНА 5/2002 89


ТЕХНОЛОГИИ И МЕТОДЫ

ке или плазме крови общеприятыми ферментатив- мости [16]. При значениях ХС ЛПВП ≥ 1,09 ммоль/л
ными методами с использованием холестеролэсте- коэффициент вариации (КВан) между сериями
разы, холестеролоксидазы и хромогенов. (случайная ошибка) должен быть ≤ 4%; среднее от-
Можно выделить несколько групп методов клонение от значений ХС ЛПВП, выполненных ре-
«прямого» определения ХС ЛПВП, различающихся ференсным методом (систематическая ошибка, Ос),
по способу изоляции ЛП, содержащих апоВ — ли- не должно превышать 5%. Систематическая ошиб-
попротеидов низкой плотности (ЛПНП), липопро- ка рассчитывается на основании уравнения линей-
теидов очень низкой плотности (ЛПОНП) и хило- ной регрессии: ось Х — данные, полученные рефе-
микронов (ХМ). ренсным методом, ось Y — данные, полученные
1. При нейтральном рН в присутствии МgCL2 методом, которым обычно работает лаборатория.
сульфатированный альфа-циклодекстрин и декст- Общая ошибка (Ооб) при измерениях, рассчитыва-
ран-сульфат образуют водорастворимые комплек- емая как сумма систематической и случайной оши-
сы с ЛПНП, ЛПОНП и ХМ. Образованные компле- бок, Ооб = 1,96х КВан + Ос, должна быть ≤ 13%.
ксы не способны реагировать с ферментами, моди- Данные о величине общей ошибки при опреде-
фицированными полиэтиленгликолем (ПЭГ). Пос- лении ХС ЛПВП прямыми и преципитационными
кольку частицы ЛПВП не включены в названные методами неоднозначны [6,11,13]. Если по воспро-
комплексы, ХС ЛПВП взаимодействует с фермента- изводимости определения практически все методы
ми, соединенными с ПЭГ — холестеролоксидазой и удовлетворяют заданным критериям, то при оценке
холестеролэстеразой, — и системой хромогенов. правильности определения получены различные, в
2. Синтетические полимеры и полианионы ад- некоторых случаях противоположные данные. Та-
сорбируются на поверхность ЛПНП, ЛПОНП и ХМ ким образом, все методы определения ХС ЛПВП
и превращают эти ЛП в стабильные комплексы, не- имеют свои недостатки. Референсные методы,
доступные для реакции. Далее детергент удаляет не- включающие ультрацентрифугирование и опреде-
большое количество полимеров, обратимо связан- ление ХС химическими методами, слишком трудо-
ных с ЛПВП, и ХС этого класса ЛП вступает в реак- емки для рутинного использования. Преципитаци-
цию с ферментами и хромогенами, что позволяет онные методы увеличивают вероятность случайных
определить концентрацию ХС только в ЛПВП. ошибок. Прямые методы в ряде случаев представля-
3. Иммунопреципитация — антитела к апоВ ют данные, имеющие систематическую ошибку.
человека реагируют со всеми классами ЛП, кроме Значения ХС ЛПВП, полученные «прямыми»
ЛПВП — ЛПНП, ЛПОНП и ХМ. Образованные методами, достоверно и высокозначимо коррелиру-
комплексы не вступают в ферментативные реакции ют со значениями ХС, определенными во фракции
определения ХС, и т.о. в результате названных реак- ЛПВП, выделенной ультрацентрифугированием
ций измеряют содержание ХС только во фракции или при использовании преципитации для удаления
ЛПВП. ЛП, содержащих апоВ. В то же время, в некоторых
4. На первой стадии холестеролэстераза и холе- случаях несмотря на достоверную корреляцию, в
стерооксидаза воздействует на ХС всех ЛП (ЛПНП, уравнении регресии, описывающем связь значений,
ЛПОНП и ХМ), кроме ЛПВП. Н202, образованная в полученных разными методами, коэффициент на-
результате окисления ХС, разрушается под действи- клона кривой достоверно отличается от единицы, а
ем каталазы. На второй стадии концентрацию ХС значение смещения достоверно отличается от нуля
ЛПВП измеряют ферментативным методом с уча- [13]. Это означает, что значения ХС ЛПВП, получен-
стием хромогенов. ные разными методами, могут быть различными.
Проведенные исследования показали, что все Одной из причин несовпадения значений мо-
предложенные «прямые» методы определения ХС жет быть способ выделения ЛПВП. Например, хотя
ЛПВП обладают высокой чувствительностью и спе- применение последовательного ультрацентрифуги-
цифичностью, линейностью в необходимых преде- рования позволяет точно выделить частицы соот-
лах, прекрасной воспроизводимостью [6, 11, 13]. Ре- ветствующей плотности, деление ЛП по плотности
зультаты определения незначительно подвержены иногда может не соответствовать белковому составу
влиянию повышенной концентрации гемоглобина, ЛП, разделению их на апоВ- и апоА-ЛП; ультрацен-
билирубина и триглицеридов. Однако при исполь- трифугирование вызывает денатурацию белков и
зовании ряда методов отмечают влияние на резуль- потерю некоторых элементов ЛПВП [2, 14]. Более
таты диспротеинемий и парапротеинемий [13]. того, А.Н. Климов полагает, что выделенные классы
Согласно рекомендациям Национальной обра- ЛП «отражают не только то, что представляют со-
зовательной программы по холестерину, метод оп- бой ЛП плазмы, взятой для анализа, но и то, что
ределения ХС ЛПВП должен удовлетворять опреде- произошло с ними при длительном многочасовом
ленным критериям правильности и воспроизводи- ультрацентрифугировании в концентрированном

90 ЛАБОРАТОРНАЯ МЕДИЦИНА 5/2002


ТЕХНОЛОГИИ И МЕТОДЫ

солевом растворе при заданной величине плотно- 5. Assman G., Schriewer H., Schopohl B. et al. Investigation
сти» [1]. of the specificity of the HDL-cholesterol test. //
Lipoproteins and coronary heart disease. Ed. Greten H.,
Другой причиной несовпадения уровня ХС Lang P., Schettler G.– Gerhard Witzstrock Publishing
ЛПВП, определенных разными методами, могут House. – 1980.– N.Y.– Baden-Baden– Cologne.
быть особенности строения и состава ЛПВП у от- 6. Cobbart C., Mulder P., Baadenhuijensen H. et al.// Survey
дельных пациентов. Изменения состава ЛПВП от- of total error of precipitation and homogenous HDL-
мечены при болезнях печени, алкоголизме, некото- cholesterol methods and simultaneous evaluation of
рых наследственных болезнях [2]. Хотя известно, lyophilized saccharose-containing candidate reference
что при электрофорезе ЛПВП обладают альфа-под- materials for HDL-cholesterol.
7. Demacker P., Hessels M., Toenhake H. et al. Precipitation
вижностью, значительная подфракция апоА-I обна-
methods for high-density lipoprotein cholesterol meas-
ружена в частицах с пре-бета подвижностью [14]. urement compared, and final evaluation under routine
Установлено, что последовательное ультрацентри- operating conditions of a method with a low-to-reagent
фугирование не позволяет выделить пре-бета ratio.// Clin. Chem.– 1997.– V.43.– P.663-668.
ЛПВП. Эта подфракция, отличающаяся по структу- 8. Expert panel on detection, evaluation and treatment of
ре и свойствам от альфа-ЛПВП, может составлять high blood cholestrol in adults/ Executive summary of
до 10 и более процентов всей фракции ЛПВП. При the third report of the National Cholesterol Education
program (NCEP) expert panel on detection, evaluation
ряде распространенных заболеваний, в том числе
and treatment of high blood cholestrol in adults (Adult
диабете, ИБС, гипертонической болезни, соотноше- Treatment Panel III) // JAMA. 2001.– V.285. P.2486-
ние основных подфракций ЛПВП — ЛПВП2 и 97.
ЛПВП3 — отличается от такового у здоровых лиц 9. Gofman J., Lindgren F., Elliot H. et al. The role of lipids
[2,14]. and lipoproteins in atherosclerosis// Science.– 1950.–
Таким образом, сопоставимость средних значе- v.111.– p. 166-177.
ний ХС ЛПВП, полученные разными методами, 10. Illingworth D., Durrington P. Dyslipidemia and athero-
sclerosis: how much more evidence do we need? Curr.
подтвержденная высокозначимой достоверной кор-
Opin. Lipidol.– 1999.– V.10.– P.383-386.
реляционной зависимостью, совершенно не означа- 11. De Keijzer M., Elbers H., Baadenhuijsen H. et al.
ет, что у каждого пациента разными методами будут Evaluation of five different high-density lipoprotein cho-
получены идентичные значения ХС ЛПВП. Можно lesterol assays: the most precise are not the most accu-
полагать, что описанное несовпадение значений в rate.//Ann. Clin. Biochem. -1999.– V/ 36.– P. 168-175.
основном обусловлено двумя причинами: способом 12. Kostner G., Avogaro P., Bittolo Bon G. et al.
выделения ЛПВП и особенностями строения и со- Determination of high density lipoproteins: screening
methods compared // Clin. Chem.– 1979.– V.25.– P.939-
става частиц ЛПВП пациента. В этой связи при вы-
942.
боре метода для определения ХС ЛПВП, руководст- 13. Nauck M., Graziani M., Jarausch J. et al. A new liquid
вуясь задачами исследования, следует учесть все до- homogenous assay for HDL-cholesterol determination
стоинства и недостатки предлагаемых методов и evaluated in seven laboratories in Europe and the United
главное, не забывать одно из основных правил ла- States.// Clin.Chem.Lab.Med.– 1999.– V. 37.– P.1067-
бораторной диагностики нарушений липидного об- 1076.
мена: выполнение анализов всех пациентов, вклю- 14. Tall A., Breslow J. Plasma high density lipoproteins and
atherogenesis.// Atherosclerosis and coronary artery dis-
ченных в программу, должно быть проведено од-
ease. -Ed. by Fuster V., Ross R., Topol E.-1996.–
ним методическим приемом. Lippincott-Raven Press Publishers.– Philadelphia. P.105-
127.
15. Warnick G., Nauck M., Rifai N. Evolution of methods for
Литература measurement of HDL-cholesterol: from ultracentrifuga-
tion to homogenous assays.//Clin.Chem.– 2001.– v.47.–
1. А.Н. Климов. Липопротеиды плазмы крови: некото- P.1579-1596.
рые нерешенные и дискуссионные вопросы.// Тезисы 16. Warnick G., Wood P. For the National Cholesterol
докладов YI симпозиума по биохимии липидов.– С- Education Program Working Groop on Lipoprotein
Пб.– 1994. С.3-11. Measurement. National Cholesterol Education Program
2. Климов А., Никульчева Н. Обмен липидов и липо- Recomendations for Measurement of high density
протеидов и его нарушения.– С-Пб: «Питер», 1999.– lipoprotein cholesterol: executive summary. //Clin.
512 с. Chem.– 1995.– V. 41.– P. 1427-1433.
3. Творогова М.Г. Обратный транспорт холестерина.// 17. Wood D., De Backer G., Faergeman O. et al. Prevention of
Кардиология. -2001.– N2.– С.66-72. coronary heart disease in clinical practice. Recommenda-
4. Творогова М.Г. Лабораторная диагностика наруше- tions of the Second Joint Task Force of European and
ний липидного обмена.//Лабораторная медицина.– other societies on coronary prevention // Eur. Heart J.–
2001.– N 4.– С.67-74. 1998.– V.19.– P.1434-1503.

ЛАБОРАТОРНАЯ МЕДИЦИНА 5/2002 91