4
ФЕРМЕНТЫ
Ф
ерменты можно определить как биологи
ческие катализаторы. Катализатором на
зывают вещество, ускоряющее реакцию,
но само в реакции не изменяющееся. Поскольку
ферменты представляют собой белковые моле
кулы, синтезируемые в живой клетке, их называ
ют биологическими катализаторами. В любой
клетке человеческого тела содержатся тысячи
ферментов. Они катализируют многочисленные
химические реакции, протекающие здесь при
температурах, совместимых с жизнью, т. е. в пре
делах от 5 до 40 °C. Чтобы эти реакции с той же
скоростью осуществлялись вне организма, по
требовались бы высокие температуры и резкие
изменения некоторых других условий, что было
бы для клетки губительным. Ферменты абсолют
но необходимы, поскольку без них реакции в
клетке протекали бы слишком медленно и не
могли бы поддерживать жизнь.
Вещество, превращения которого катализи
рует данный фермент, называют субстратом этого
фермента. Соединяясь с субстратом, фермент
образует короткоживущий ферментсубстрат
ный комплекс. В таком комплексе шансы на то,
что реакция произойдет, значительно возраста
ют. По завершении реакции ферментсубстрат
ный комплекс распадается на продукт (или про
дукты) и фермент. Фермент в реакции не изменя
ется и по ее окончании может снова взаимодей
ствовать с новой молекулой субстрата:
Субстрат + Фермент Фермент Комплекс
(S) (E) субстратный фермент–
комплекс (ES) продукт (EP)
Фермент + Продукт (P)
(Е) (продукты)
или:
E+S ES EP E+P
Анаболизм и катаболизм
Совокупность всех химических реакций, проте
кающих в клетке, составляет то, что мы называ
ем метаболизмом. Метаболизм подразделяется на
анаболизм и катаболизм — два разных типа реак
ций, которые нередко протекают и в разных час
тях клетки. Катаболические реакции, или реакции
распада, обычно сопровождаются высвобожде
нием энергии. По большей части это окисление
и гидролиз. Анаболические реакции, или реакции
синтеза, наоборот, требуют затрат энергии. Часто
это реакции конденсации. Все эти реакции про
текают с участием ферментов. Примером фер
мента, участвующего в анаболизме, может слу
жить глутаминсинтетаза, катализирующая син
тез аминокислоты глутамина из глутаминовой
кислоты и аммиака:
Глутаминсинтетаза
Глутаминовая + Аммиак + АТФ Глутамин +
кислота
+ Вода + АДФ + Фн
(АТФ — аденозинтрифосфат; АДФ — аденозин
дифосфат; Фн — неорганический фосфат). В ка
честве примера фермента, участвующего в ката
болизме, можно назвать мальтазу:
Мальтаза
Крахмал + Вода Мальтоза
Метаболические пути
Обычно данное исходное вещество превраща
ется в продукт (или продукты) через ряд про
 Ферменты 153
межуточных соединений, в образовании кото зирует только расщепление пероксида во
рых принимают участие несколько фермен дорода.
тов, действующих последовательно один за 7. Катализируемая ферментом реакция об
другим. Такая последовательность реакций ратима.
составляет так называемый метаболический
путь. В клетке работает одновременно много 8. Активность ферментов меняется в зависи
метаболических путей. Реакции протекают со мости от pH и температуры, а также от
гласованно, подчиняясь строгой регуляции, концентрации как субстрата, так и самого
что объясняется специфической природой фермента (об этих факторах мы будем го
ферментов. Один фермент обычно катализи ворить в разд. 4.3).
рует только одну реакцию. Таким образом, 9. Ферменты снижают энергию активации
ферменты служат для регулирования происхо катализируемой реакции (разд. 4.1.1).
дящих в клетке реакций и обеспечивают над 10. В молекуле фермента есть активный
лежащую их скорость. центр, который вступает в контакт с суб
стратом. Этот активный центр имеет осо
бую форму (разд. 4.1.2).
4.1. Свойства ферментов
Ферменты характеризуются следующими основ
ными свойствами. 4.1.1. Энергия активации
1. Все они представляют собой глобулярные Представим себе смесь бензина и кислорода.
белки. Реакция между этими двумя веществами с тер
модинамической точки зрения возможна, но
2. Информация о них, как и о других белках,
она не пойдет без затраты некоторого количе
закодирована в ДНК.
3. Ферменты действуют как катализаторы
(см. выше). А
4. Их присутствие не влияет ни на природу,
ни на свойства конечного продукта (или
продуктов) реакции.
5. Ферменты действуют чрезвычайно эф
фективно, т. е. очень малое количество
фермента вызывает превращение боль
ших количеств субстрата. Одна молеку
ла каталазы способна, например, при
температуре тела разложить за одну се
кунду на воду и кислород около 600 ты
сяч молекул пероксида водорода. Мож Б
но сравнить эффективность каталазы и
такого, например, неорганического ка
тализатора, как диоксид марганца, доба
вив их по отдельности к пероксиду водо
рода и измерив скорость выделения кис
лорода. (Хорошим источником каталазы
служит печень). В среднем ферменты
способны катализировать около 1000
реакций в секунду. Без катализаторов
реакции протекали бы в миллионы раз Рис. 4.1. А. Энергия активации для катализируемой
медленнее. и некатализируемой реакции. Б. Аналогичная ситу
ация — когда валун скатывается с холма, высво
6. Ферменты высокоспецифичны, т. е. один бождается больше энергии, чем было затрачено на
фермент катализирует обычно только од то, чтобы поднять его на холм и заставить ска
ну реакцию. Каталаза, например, катали титься.
154 Глава 4
ства энергии, поступившей, например, в фор
ме простой искры. Так же обстоит дело и со
спичкой. Содержащиеся в спичечной головке
вещества могут вступить в реакцию, суммар
ным итогом которой будет выделение энергии,
но чтобы запустить реакцию, придется сначала
затратить небольшое количество энергии (до
статочно тепловой энергии, выделяющейся,
когда мы чиркаем спичкой о коробок). Энер
гия, необходимая для того, чтобы заставить ве
щества вступить в реакцию, называется энер
гией активации. Ферменты, действуя как ката
лизаторы, снижают энергию активации
(рис. 4.1). Они повышают общую скорость ре
акции, не изменяя в скольконибудь значи
тельной степени температуру, при которой эта
реакция протекает.

4.1.2. Механизм действия ферментов

Ферменты обладают очень высокой специ
фичностью. Фишер (Fischer) в 1890 г. выска
зал предположение, что эта специфичность
обусловливается особой формой молекулы
фермента, точно соответствующей форме мо
лекулы субстрата (или субстратов). Эту гипо
тезу часто называют гипотезой «ключа и зам
ка»: субстрат сравнивается в ней с «ключом»,
который точно подходит по форме к «замку»,
т. е. к ферменту. В схематическом виде это
представлено на рис. 4.2. Часть молекулы
фермента, вступающую в контакт с субстра
том, называют активным центром фермента, и
именно активный центр фермента имеет осо
бую форму.
Молекулы большей части ферментов во мно
го раз крупнее, чем молекулы тех субстратов, ко
торые атакует данный фермент. Активный же
центр фермента составляет лишь очень неболь
шую часть его молекулы, обычно от 3 до 12 ами
нокислотных остатков. Роль остальных амино
кислот, составляющих основную массу фермен
та, заключается в том, чтобы обеспечить его
молекуле правильную глобулярную форму, кото
рая, как мы увидим далее, очень важна для наи
более эффективной работы активного центра
фермента. Рис. 4.2. А. Схема, иллюстрирующая гипотезу «клю
Образовавшиеся продукты по форме уже не ча и замка», предложенную Фишером для объяснения
соответствуют активному центру фермента. Они действия ферментов. Б. Более детальное схемати
ческое изображение ферментсубстратного комп
отделяются от него (поступают в окружающую лекса. Аминокислотные остатки, образующие ак
среду), после чего освободившийся активный тивный центр фермента, пронумерованы в соот
центр может принимать новые молекулы суб ветствии с их положением в первичной структуре
страта. фермента.
 Ферменты 155

Рис. 4.3. Схемы, иллюстрирующие кошландовскую гипотезу индуцированного соответствия. А. Простая

схема, поясняющая механизм действия. Фермент в результате присоединения субстрата к активному
центру слегка изменяет форму, и соответственно становится более объемным. Б. Более подробная схема.
Соединяясь с ферментом, субстрат вызывает в нем изменение, в результате которого активные группы
фермента сближаются. (По J. C. Marsden, C. F. Stoneman (1977), Enzymes and equilibria, Heinemann
Educational Books.)

В 1959 г. Кошланд (Koshland) предложил
новую интерпретацию гипотезы «ключа и зам
ка», получившую название гипотезы «индуциро
ванного соответствия». На основе данных, по
зволяющих считать ферменты и их активные
центры физически более гибкими, чем это ка
залось вначале, он заключил, что субстрат, со
единяясь с ферментом, вызывает какието из
менения в структуре его активного центра.
Аминокислотные остатки, составляющие ак
тивный центр фермента, принимают опреде
ленную форму, которая дает возможность фер
менту наиболее эффективным образом выпол
нять свою функцию (рис. 4.3). Подходящей
аналогией в этом случае может служить пер
чатка, которая при надевании на руку соответ
ствующим образом изменяет свою форму. По
мере выяснения отдельных деталей механизма
различных реакций в эту гипотезу вносятся
уточнения.
Представление о том, как работает фермент,
можно получить с помощью рентгеноструктур
ного анализа и компьютерного моделирования.
Рис. 4.4 иллюстрирует это на примере фермента
лизоцима.
156 Глава 4
А Б В

Рис. 4.4. Созданные на компьютере модели третичной структуры лизоцима до и после присоединения субстрата,
показывающие, как работает этот фермент. А. Вид сбоку. Активный центр имеет форму щели, проходящей по
всей толще молекулы. Б. Вид сбоку. Активный центр с находящейся в нем молекулой субстрата. Обратите внима
ние на некоторое изменение формы фермента, вызванное присоединением субстрата. Это пример «индуцирован
ного соответствия», постулированного Кошландом в 1959 г. Субстрат лизоцима представляет собой короткую
олигосахаридную цепь, легко умещающуюся в активном центре и расщепляемую ферментом. Такие олигосахариды
входят в состав бактериальных клеточных стенок и их разрушение влечет за собой гибель бактерий — клеточные
стенки утрачивают присущую им жесткость и клетки лопаются под действием осмотических сил. Лизоцим —
широко распространенный фермент, выполняющий защитную функцию; он содержится в слезах, слюне и в слизи
носовой полости. В. Вид спереди. Активный центр с находящейся в нем молекулой субстрата. Г. Компьютерная
модель лизоцима с субстратом в активном центре.
 Ферменты 157

4.2. Скорость ферментативных

реакций
Мерой скорости ферментативных реакций слу
жит количество субстрата, подвергшегося пре
вращению в единицу времени, или количество
образовавшегося продукта.

Рис. 4.6. Зависимость скорости ферментативной ре

акции от концентрации фермента.

Рис. 4.5. Скорость ферментативной реакции. 4.3.2. Концентрация субстрата

Скорость определяют по углу наклона каса
тельной к кривой на начальной стадии (а на
рис. 4.5) реакции. Чем круче наклон, тем больше
скорость. Со временем скорость реакции обыч
но снижается, по большей части в результате
снижения концентрации субстрата (см. след.
разд.).
4.3. Факторы, влияющие
на скорость ферментативных
реакций
Для изучения влияния какоголибо фактора
на скорость реакции все прочие факторы дол
жны оставаться неизменными и по возможно
сти иметь оптимальное значение. Измерять сле
дует только начальные скорости, как указано
выше.
При данной концентрации фермента скорость
ферментативной реакции возрастает с увеличе
нием концентрации субстрата (рис. 4.7). Теоре
тическая максимальная скорость реакции Vmax
никогда не достигается, но наступает момент,
когда дальнейшее увеличение концентрации
субстрата уже не влечет за собой скольконибудь
заметного изменения скорости реакции. Это
следует объяснить тем, что при высоких концен
трациях субстрата активные центры молекул
фермента в любой данный момент оказываются
практически насыщенными. Таким образом,

4.3.1. Концентрация фермента

При высокой концентрации субстрата и при по
стоянстве других факторов, таких, например,
как температура и pH, скорость ферментативной
реакции пропорциональна концентрации фер
мента (рис. 4.6). Катализ осуществляется всегда в
условиях, когда концентрация фермента гораздо
ниже концентрации субстрата. Поэтому с возра
станием концентрации фермента растет и ско Рис. 4.7. Зависимость скорости ферментативной ре
рость ферментативной реакции. акции от концентрации субстрата.
158 Глава 4
сколько бы ни было в наличии избыточного суб
страта, он может соединиться с ферментом лишь
после того, как образовавшийся ранее фермент
субстратный комплекс диссоциирует на продукт
и свободный фермент.
4.3.3. Температура
С повышением температуры ускоряется движе
ние молекул, вследствие чего у молекул субстра
та и фермента оказывается больше шансов стол
кнуться друг с другом. В результате увеличивает
ся и вероятность того, что реакция произойдет.
Температура, обеспечивающая максимальную
активность, называется оптимальной температу
рой. Если температура поднимается выше этого
уровня, скорость ферментативной реакции сни
жается, несмотря на увеличение частоты столк
новений. Происходит это вследствие разруше
ния вторичной и третичной структур фермента,
иными словами, вследствие того, что фермент
претерпевает денатурацию (рис. 4.8). Молекула
фермента развертывается и его активный центр
постепенно утрачивает присущую ему форму.
Наиболее чувствительны к воздействию высо
кой температуры водородные связи и гидрофоб
ные взаимодействия.
Температурный оптимум для большинства
ферментов млекопитающих лежит в пределах
37–40 °C. Существуют, однако, ферменты с бо
лее высоким температурным оптимумом; у бак
терий, живущих в горячих источниках, он может,
например, превышать 70 °C. Именно такие фер
Рис. 4.8. Зависимость скорости ферментативной ре
акции от температуры.
Рис. 4.9. Ход ферментативной реакции при разных
температурах.
менты используются в качестве добавок к сти
ральным порошкам для стирки в горячей воде.
Когда температура приближается к точке замер
зания или оказывается ниже ее, ферменты инак
тивируются, но денатурации при этом не происхо
дит. С повышением температуры их каталитиче
ская активность вновь восстанавливается.
В наше время для длительного хранения пи
щевых продуктов широко используют такой
способ, как быстрое их замораживание. Оно
предотвращает рост и размножение микроорга
низмов, а также инактивирует их пищеваритель
ные ферменты, так что они оказываются уже не в
состоянии вызвать разложение пищевых про
дуктов. Инактивируются также и ферменты,
находящиеся в самих пищевых продуктах. Замо
роженные продукты необходимо хранить при
низких температурах, не допуская их размора
живания. Последнее следует делать непосредст
венно перед приготовлением пищи.
4.1. Ознакомьтесь с рис. 4.9. Что вы можете
сказать по поводу формы трех кривых,
описывающих ход ферментативной
реакции при разных температурах?
Температурный коэффициент Q10
Влияние температуры на скорость ферментатив
ной реакции может быть выражено через темпе
ратурный коэффициент Q10:
 Ферменты 159
Скорость реакции при (x + 10) °C го центра. При слишком резких сдвигах pH фер
Q10 =
Скорость реакции при x °C мент денатурирует.

В пределах от 0–40 °C Q10 ферментативной

реакции равен 2. Иными словами, при каждом
повышении температуры на 10 °C скорость реак
ции удваивается.
4.3.4. pH
При постоянной температуре любой фермент,
как правило, работает наиболее эффективно
в узких пределах pH. Оптимальным считается
то значение pH, при котором реакция протекает
с максимальной скоростью (рис. 4.10 и табл. 4.1).
4.2. а) Укажите оптимальное значение pH
для активности фермента B на рис. 4.11.
б) Назовите в качестве примера какие-либо
известные вам ферменты, активность
которых могла бы характеризоваться
1) кривой А и 2) кривой В.
в) Почему активность фермента С снижается
между pH 8 и 9?
г) Почему регуляция активности
ферментов путем изменения pH важна
in vivo?
д) К раствору пероксида водорода
добавляли при разных значениях pH
по 1 мл раствора каталазы и отмечали
время, за которое удавалось собрать
10 мл O2. При этом были получены
следующие результаты:

Рис. 4.10. Зависимость скорости ферментативной ре pH раствора Время сбора газа,
мин
акции от pH.
4,00 20,00
При более высоких и более низких pH актив 5,00 12,50
ность фермента снижается. С понижением pH 6,00 10,00
7,00 13,60
возрастает кислотность и увеличивается концен
8,00 17,40
трация H+ионов. Увеличивается, следователь
но, количество положительных зарядов в среде.
Сдвиг pH меняет заряд ионизированных кислот Представьте эти результаты в виде графика
ных и основных групп, что ведет к разрушению и объясните их.
ионных связей, участвующих в поддержании
специфичной формы молекул фермента (разд.
3.5.3). В результате изменяется форма молекул
фермента и в первую очередь форма его активно

Таблица 4.1. Оптимум pH для некоторых фермен-

тов
Фермент Оптимум pH

Пепсин1 2,00
Сахараза 4,50
Энтерокиназа 5,50
Амилаза слюны 4,80
Каталаза 7,60
Химотрипсин 7,00–8,00
Липаза поджелудочной железы 9,00
Аргиназа 9,70
1 Содержится в желудке вместе с соляной кислотой. Рис. 4.11. Влияние pH на активность трех фермен
тов — А, В и С.
160 Глава 4
4.3.5. Лабораторные работы
Опыт 4.1. Изучение влияния концентрации
фермента на гидролиз сахарозы,
катализируемый сахаразой (инвертазой)
Материалы и оборудование
2%ный раствор сахарозы
1, 0,75 и 0,5%ный растворы сахаразы (инвертазы)
Реактив Бенедикта
12 пробирок со штативом
Водяные бани с температурой 38 и 100°C
Стеклянные палочки
Таймер
Дистиллированная вода
Этикетки
Бунзеновская горелка
Методика
1. Добавьте 2 мл прозрачного синего реакти
ва Бенедикта к 2 мл прозрачного бесцвет
ного 1%ного раствора сахаразы. Нагрейте
смесь на водяной бане при 100 °C в тече
ние 5 мин (реакция Бенедикта).
2. Повторите процедуру 1 с 2 мл прозрачного
бесцветного 2%ного раствора сахарозы,
а затем с 2 мл дистиллированной воды.
3. 5 мл 1%ного раствора сахаразы доведите
до кипения.
4. В восемь чистых сухих пробирок с этикет
ками 1–8 налейте по 1 мл реактива Бене
дикта.
5. Налейте 5 мл 2%ного раствора сахарозы
в пробирку с этикеткой S и поместите на
водяную баню, в которой на протяжении
всего эксперимента поддерживается тем
пература 38 °C.
6. Налейте 5 мл 1%ного раствора сахаразы
в пробирку с этикеткой Е и поместите ее
в водяную баню с температурой 38 °C.
7. Выдержите обе пробки вместе с их содер
жимым в водяной бане в течение 5 мин для
того, чтобы они приобрели нужную тем
пературу.
8. Добавьте раствор фермента к раствору
сахарозы и переверните пробирку, чтобы
хорошо перемешать эти два раствора.
9. Сразу же включите отсчет времени и вновь
поставьте пробирку, содержащую реакци
онную смесь, в водяную баню.
10. В течение всего опыта непрерывно пере
мешивайте реакционную смесь.
11. После 30 с инкубации перенесите 1 мл
смеси в пробирку 1.
12. С интервалом в 30 с отберите такие же
пробы и перенесите их по очереди в про
бирки 2—8.
13. Нагрейте пробирки 1—8 в водяной бане
с температурой 100 °C в течение 5 мин. От
метьте время первого появления кирпич
нокрасного осадка, свидетельствующего
о положительной реакции на редуцирую
щий сахар.
14. Повторите тот же эксперимент, использо
вав на этот раз прокипяченый раствор
фермента (см. п. 3).
15. Повторите всю последовательность про
цедур дважды: с 0,75%ным и 0,5%ным
растворами сахаразы.
16. Запишите ваши наблюдения и объясните
полученные результаты.
Опыт 4.2. Изучение распределения каталазы
в намоченных семенах гороха и влияния температуры
на активность этого фермента
Каталаза — это фермент, катализирующий раз
ложение пероксида водорода с образованием
молекулярного кислорода, выделяющегося в ви
де пузырьков газа:
Каталаза
2H2O2 2H2O + O2
Пероксид водорода образуется в некоторых
растительных и животных клетках в качестве по
бочного продукта метаболизма. Соединение это
токсично для клеток, и каталаза обеспечивает
эффективное его удаление. Каталаза — один из
наиболее быстро работающих ферментов.
Материалы и оборудование
Горсть намоченного гороха
Раствор пероксида водорода
Пробирки со штативом
Водяные бани с температурой 40, 50, 60, 70, 80 и 100 °C
Часы

Термометр
Скальпели, ножницы и пинцеты
Держатель для пробирок
Стеклянная палочка
Белая кафельная плитка
Методика
1. Убедитесь в наличии каталазы. Для этого
разомните одну горошину и нанесите на
нее несколько капель пероксида водорода.
2. Снимите с трех горошин кожуру и про
верьте на каталазу по отдельности кожуру
и семядоли.
3. Поставьте две пробирки с дистиллирован
ной водой в водяную баню с температурой
40 °C.
4. Прокипятите в отдельной пробирке три
целые горошины, а затем поместите их
в одну из пробирок на водяной бане.
5. В другую пробирку на водяной бане поло
жите три горошины, не подвергавшиеся
кипячению.
6. Выдержите пробирки в водяной бане в те
чение времени, достаточного для того,
чтобы они приняли ее температуру (около
10 мин).
7. Проверьте каждую из горошин на каталаз
ную активность.
8. Повторите тот же эксперимент при 50, 60,
70, 80 и 100 °C.
9. Запишите ваши наблюдения и объясните
полученные результаты.
Опыт 4.3. Изучение влияния различных значений pH
на активность фермента
Материалы и оборудование
Реактив Бенедикта
Буферные растворы с pH 3, 5, 7, 9 и 11
1%ный раствор крахмала
Водяная баня с температурой 38 °C
Бунзеновская горелка
Асбест
Держатель для пробирок, штатив с пробирками
Градуированные пипетки на 5 мл
Термометр
Таймер
Ферменты 161
Дистиллированная вода
Исходный раствор амилазы (такой, какая содержится в
слюне)
Методика
1. Сполосните рот 5 мл дистиллированной
воды и выплюньте эту воду.
2. Наберите в рот 10 мл дистиллированной
воды, пополощите в течение 1 мин и эту
жидкость соберите.
3. Доведите объем этого раствора амилазы
слюны до 40 мл дистиллированной водой.
4. Проверьте растворы амилазы, крахмала и
буферные растворы на присутствие в них
редуцирующих сахаров с помощью реак
тива Бенедикта.
5. Пометьте этикеткой «pH 3» одну из проби
рок и внесите в нее 2 мл раствора крахмала.
6. Добавьте в ту же пробирку 2 мл буферного
раствора с pH 3 и тщательно перемешайте
оба раствора.
7. Прокипятите не менее 4 мл раствора фер
мента и влейте 4 мл этого раствора в про
бирку с соответствующей этикеткой.
8. В другую пробирку, также снабженную
этикеткой, влейте 4 мл раствора фермента,
не подвергавшегося кипячению; поставьте
все три пробирки в водяную баню и вы
ждите некоторое время (около 1 мин) для
того, чтобы они успели нагреться до 38 °C.
9. Влейте небольшое количество реактива
Бенедикта в каждую из 11 пробирок и по
метьте их цифрами 1—11. Следующие три
этапа должны быть проведены очень бы
стро.
10. Когда растворы в водяной бане примут ее
температуру, влейте забуференный рас
твор крахмала в некипяченый раствор
фермента.
11. Хорошо перемешайте оба раствора, пере
ворачивая пробирку, а затем снова по
ставьте пробирку в водяную баню.
12. Включите отсчет времени и сразу же пере
несите небольшое количество реакцион
ной смеси (примерно равное по объему
взятому реактиву Бенедикта) в пробирку 1.
13. На протяжении всего опыта энергично
встряхивайте смесь.
162 Глава 4
14. По истечении 1 мин перенесите в пробир
ку 2 вторую порцию реакционной смеси
(приблизительно того же объема, что и
первая).
15. Повторяйте ту же процедуру с интервала
ми 1 мин в течение еще 9 мин (т. е. запол
ните отобранными пробами пробирки
3–11).
16. Отметьте для пробирок 1–11 продолжи
тельность инкубации, требуемой для по
явления первых признаков положитель
ной реакции Бенедикта (выпадения кир
пичнокрасного осадка).
17. Повторите тот же опыт с прокипяченым
раствором фермента, начиная от п. 7.
18. Повторите весь опыт целиком с каждым из
остальных буферных растворов.
19. Постройте график зависимости времени
гидролиза от pH и объясните полученные
результаты.
4.4. Ингибирование ферментов
Известны различные низкомолекулярные
соединения, которые могут снижать скорость
ферментативных реакций. Такие соединения
называются ингибиторами ферментов. Важно по
нимать, что ингибирование — это один из нор
мальных способов регулирования активности
ферментов. Многие лекарственные препараты и
яды также действуют как ингибиторы фермен
тов. Ингибирование бывает конкурентным и
неконкурентным. Неконкурентное ингибирова
ние может быть обратимым и необратимым.
4.4.1. Конкурентное ингибирование
В этом случае вещество, близкое по своей струк
туре к обычному субстрату фермента, соединяет
ся с активным центром фермента, но не может
прореагировать с ним. Находясь здесь, оно пре
граждает доступ к активному центру любой мо
лекуле настоящего субстрата. Поскольку в этом
случае ингибитор и субстрат конкурируют за мес
Рис. 4.12. Конкурентное ингибирование. А. Простая
схема, поясняющая механизм ингибирования. Б. Фер
мент сукцинатдегидрогеназа катализирует превра
щение янтарной кислоты в фумаровую. В. Конкурент
ное ингибирование фермента малоновой кислотой.

то на активном центре фермента, эту форму ин
гибирования называют конкурентным ингибирова
нием. Для конкурентного ингибирования харак
терно, что, если концентрация субстрата увели
чивается, то скорость реакции возрастает, т. е.
это ингибирование обратимо.
4.3. Почему при этих условиях скорость
реакции возрастает?
Рис. 4.12 иллюстрирует один из примеров
конкурентного ингибирования.
Явление конкурентного ингибирования по
могает понять механизм действия некоторых ле
карственных препаратов, в частности сульфа
ниламидов. Цель химиотерапии — уничтожить
при помощи тех или иных химических препара
тов возбудителя болезни, не повреждая при этом
ткани организмахозяина. Первыми такими пре
паратами были сульфаниламиды, антибактери
альное действие которых было обнаружено в
30е годы XX в. Во время Второй мировой войны
их широко применяли для борьбы с раневыми
инфекциями. Сульфаниламиды по своей хими
ческой природе близки к парааминобензойной
кислоте (ПАБК) — необходимому фактору роста
многих патогенных бактерий. ПАБК требуется
бактериям для синтеза фолиевой кислоты, кото
рая служит у них одним из кофакторов фермен
тов. Сульфаниламиды ингибируют один из фер
ментов, участвующих в синтезе фолиевой кисло
ты из ПАБК.
Животные клетки нечувствительны к суль
фаниламидам, хотя им для некоторых реакций
и требуется фолиевая кислота. Объясняется
это тем, что они используют уже образованную
фолиевую кислоту; метаболический путь, ко
торый бы обеспечивал ее синтез, у них отсутст
вует.
4.4.2. Неконкурентное обратимое
ингибирование
Ингибиторы этого типа не родственны по своей
структуре субстрату данного фермента; в образо
вании комплекса с ингибитором в этом случае
участвует не активный центр фермента, а какая
нибудь другая часть его молекулы. Это не пре
пятствует соединению субстрата с ферментом,
Ферменты 163
но делает невозможным катализ. С повышением
концентрации ингибитора скорость реакции все
более снижается. К моменту насыщения инги
битором она оказывается практически равной
нулю. В отличие от конкурентного ингибирова
ния в этом случае повышение концентрации
субстрата на скорость реакции не влияет.
4.4.3. Неконкурентное необратимое
ингибирование
Некоторые вещества вызывают необратимое ин
гибирование ферментов. Рассмотрим два приме
ра такого рода.
Очень малые концентрации ионов тяжелых
металлов, например ионов ртути (Hg2+), серебра
(Ag+) и мышьяка (As+), а также определенные
иодсодержащие соединения полностью ингиби
руют некоторые ферменты. Эти вещества необра
тимо соединяются с сульфгидрильными группа
ми (–SH) в молекуле фермента (рис. 4.13), при
чем сульфгидрильные группы могут находиться
как в активном центре фермента, так и вне его.
В любом случае структура фермента нарушается и
он теряет способность осуществлять катализ. Мо
жет произойти и осаждение ферментного белка.
Другой пример необратимого ингибирова
ния — действие диизопропилфторфосфата
(ДФФ), соединения из группы нервнопарали
тических отравляющих веществ. ДФФ связы
вается с остатком аминокислоты серина, нахо
дящимся в активном центре фермента ацетил
холинэстеразы. Этот фермент инактивирует
ацетилхолин, играющий роль нейромедиатора.
Одна из функций ацетилхолина заключается
в обеспечении передачи нервного импульса от
одного нейрона к другому через синаптическую
Рис. 4.13. Необратимое ингибирование фермента
иодуксусной кислотой. Иод вступает в реакцию
с сульфгидрильными группами фермента.
164 Глава 4
щель (гл. 17). Почти сразу после передачи оче
редного импульса ацетилхолинэстераза инакти
вирует ацетилхолин, расщепляя его молекулы.
Если ацетилхолинэстераза ингибирована, то
ацетилхолин накапливается, нервные импульсы
следуют один за другим, и мышца длительное
время не расслабляется. В конце концов насту
пает паралич, а может наступить и смерть,
поскольку затронутыми оказываются также
мышцы грудной клетки, в результате чего про
исходит остановка дыхания. Некоторые из при
меняемых в настоящее время инсектицидов
(например, паратион) оказывают такое же дей
ствие на насекомых. Нервную и мышечную си
стемы человека они тоже способны повреждать.
4.4. Объясните, почему изменение концентрации
субстрата не влияет на неконкурентное
ингибирование.
4.4.4. Аллостерические ферменты
Один из самых обычных способов регуляции
метаболических путей — это регуляция с по
мощью аллостерических ферментов. Аллосте
рическими называют ферменты, действие кото
рых «по определению» связано с изменением
формы ('allos — иной, другой; stere'оs — форма).
Рис. 4.14. Аллостерическое ингибирование.
Активность таких ферментов регулируют веще
ства, действующие подобно неконкурентным
ингибиторам. Эти вещества присоединяются
к ферментам в особых участках, удаленных от
активного центра, и меняют активность фер
мента, вызывая обратимое изменение в струк
туре активного центра.
В результате меняется и способность субстра
та связываться с ферментом (чем данное явление
и отличается от неконкурентного ингибирова
ния; разд. 4.4.2). Действующие таким образом
вещества называются аллостерическими ингибито
рами. Рис. 4.14 поясняет механизм аллостериче
ского ингибирования.
Примером данного явления служит реакция,
протекающая во время гликолиза, который со
ставляет одну из стадий процесса клеточного ды
хания. Клеточное дыхание служит источником
АТФ. Если концентрация АТФ высока, то АТФ,
действуя как аллостерический ингибитор, подав
ляет активность одного из ферментов гликолиза.
Если же клеточный метаболизм усиливается, а
следовательно, АТФ расходуется и его общая кон
центрация падает, то после того как ингибитор
будет удален, данный метаболический путь снова
вступает в действие. Это может также служить
примером ингибирования конечным продуктом.
Ингибирование конечным продуктом
(ингибирование по принципу отрицательной
обратной связи — ретроингибирование)
Когда конечный продукт какоголибо метаболи
ческого пути начинает накапливаться, он может
действовать как аллостерический ингибитор на
фермент, контролирующий первый этап этого
Рис. 4.15. Ингибирование конечным продуктом. Специ
фические ферменты, катализирующие отдельные
этапы данного метаболического пути, обозначены
буквами e1– e4.

пути. Таким образом, продукт, накапливаясь,
приостанавливает свое дальнейшее образование.
Процесс этот саморегулирующийся: как только
продукт будет израсходован, его образование
возобновится. Данное явление — ингибирова
ние конечным продуктом — представляет собой
пример механизма, действующего по принципу
отрицательной обратной связи (рис. 4.15) (см. также
гл. 19).
4.5. Ниже изображен разветвленный
метаболический путь:
e2 e3 e4
e1
B C D X
A e8
e6 e7
e5
P Q R S
а) Известно, что e1 специфичен для A
и что конечный продукт X ингибирует e1.
Учитывая это, что можно сказать о том,
в каких участках молекулы фермента
связывается A и X?
б) Как может избыток X регулировать
данный метаболический путь?
в) Как называется тип регуляции,
действующей в этой системе?
4.5. Кофакторы ферментов
Многим ферментам для эффективной работы
требуются те или иные небелковые компоненты,
называемые кофакторами. Кофакторы — это
вещества, присутствие которых совершенно
необходимо для проявления каталитической
активности ферментов, хотя сами они в отличие
от ферментов сохраняют стабильность при до
вольно высоких температурах. Роль кофакторов
могут играть различные вещества — от простых
неорганических ионов до сложных органиче
ских молекул; в одних случаях они остаются
неизменными в конце реакции, в других — ре
генерируют в результате того или иного последу
ющего процесса. Кофакторы подразделяются на
три типа: неорганические ионы, простетические
группы и коферменты. Их мы и рассмотрим
в последующих трех разделах.
Ферменты 165
4.5.1. Неорганические ионы
(активаторы ферментов)
Полагают, что эти ионы заставляют молекулы
фермента или субстрата принять форму, способ
ствующую образованию ферментсубстратного
комплекса. Тем самым увеличиваются шансы на
то, что фермент и субстрат действительно проре
агируют друг с другом, а следовательно, возра
стает и скорость реакции, катализируемой дан
ным ферментом. Так, например, активность
амилазы слюны повышается в присутствии хло
ридионов.
4.5.2. Простетические группы
(например, ФАД, гем)
Если кофактор прочно связан с ферментом и
остается в этом связанном состоянии постоян
но, то его называют простетической группой (от
–c ke
греч. prosthe – — добавление). Роль простети
ческих групп играют органические молекулы.
Они помогают ферменту осуществлять его ката
литическую функцию, как это видно на приме
ре флавинадениндинуклеотида (ФАД). ФАД
содержит рибофлавин (витамин В2), который
является водородакцепторной частью его мо
лекулы (рис. 4.16). Функция ФАД связана с
окислительными путями клетки, в частности с
процессом дыхания, в котором ФАД играет
роль одного из переносчиков в дыхательной це
пи (гл. 9).
Конечный результат: 2H переносятся от A
к B. В качестве связующего звена между A и B
действует один фермент. AH2 и B вступают
в соединение с активным центром фермента,
и ФАД передает H2 от одного субстрата к дру
гому.
Гем
Гем — это железосодержащая простетическая
группа. Его молекула имеет форму плоского
кольца (порфириновое кольцо, такое же, как у хло
рофилла), в центре которого находится атом же
166 Глава 4

Рис. 4.16. Строение одной из простетических групп — флавинадениндинуклеотида (ФАД). ФАД представляет
собой динуклеотид, образованный в результате соединения двух нуклеотидов. Нуклеотид состоит из сахара,
основания и фосфата. В данном случае нуклеотиды представлены флавинмононуклеотидом (ФМН) и аденозин
монофосфатом (АМФ). Обратите внимание, что в состав одного из нуклеотидов (ФМН) входит рибофлавин
(витамин В2 ). Этот витамин, следовательно, должен содержаться в рационе.

леза. Гем выполняет в организме ряд биологиче ческих групп они сохраняют связь с ферментом
ски важных функций. только в ходе реакции. Все коферменты пред
ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ. В качестве простетиче ставляют собой производные витаминов.
ской группы цитохромов (см. дыхательную
цепь в гл. 9) гем выступает как переносчик Никотинамидадениндинуклеотид (НАД)
электронов. Присоединяя электроны, железо (рис. 4.17)
восстанавливается до Fe(II), а отдавая их, окис
НАД — производное витамина ниацина («нико
ляется до Fe(III). Гем, следовательно, принима
тиновой кислоты») — может существовать как
ет участие в окислительновосстановительных
в окисленной, так и в восстановленной форме.
реакциях за счет обратимых изменений валент
В окисленной форме НАД при катализе играет
ности железа.
роль акцептора водорода:
ПЕРЕНОС КИСЛОРОДА. Гемоглобин и миогло
бин — два гемсодержащих белка, осуществляю
щих перенос кислорода. Железо находится в них
в восстановленной, Fe(II), форме (гл. 14).
КАТАЛИТИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ. Гем входит в состав
каталаз и пероксидаз, катализирующих рас
щепление пероксида водорода до кислорода
и воды. Содержится он также и в некоторых где e1 и e2 — две разные дегидрогеназы.
других ферментах. Конечный результат: 2H переносятся от А
к В. Здесь в качестве связующего звена между
двумя различными ферментными системами e1
4.5.3. Коферменты (например, НАД, НАДФ, и e2 действует кофермент.
ацетилкофермент А, АТФ)
Коферменты, как и простетические группы, —
4.6. Перечислите характерные свойства
это органические молекулы, выполняющие
ферментов.
функцию кофакторов, но в отличие от простети
 Ферменты 167

Рис. 4.17. Строение кофермента НАД (никотинамидадениндинуклеотида) и НАДФ (НАД с дополнительной фос
фатной группой). НАД и НАДФ представляют собой динуклеотиды (см. рис. 4.16). Обратите внимание, что ни
котинамид (ниацин), входящий в состав одного из нуклеотидов, является витамином. АМФ близок по своей
структуре к АТФ (в молекуле которого имеются две дополнительные фосфатные группы). АТФ служит в клет
ке носителем энергии. Он образуется в процессе клеточного дыхания.