Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
14 Иммун 5 Реакции
14 Иммун 5 Реакции
Лекция № 14 Иммунология – 5.
1
Лекция обсуждена на
кафедральном совещании
« »____________ 2009 г
Ставрополь, 2009 г
1
Иммунология – 5 «Реакции иммунитета» № 14
4
Иммунология – 5 «Реакции иммунитета» № 14
Реакции агглютинации
7 Реакция агглютинации – РА (от лат. agglutinatio – склеивание) –
простая по постановке реакция, при которой происходит связывание
гомологичными антителами (агглютининами) корпускулярных антигенов –
агглютиногенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых
частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных
агрегатов) в присутствии электролитов (ИХН). В результате образуются
хорошо видимые хлопья агглютината, который выпадает в растворе в виде
осадка.
Применяются различные варианты реакции агглютинации:
развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Реакция агглютинации
проявляется образованием хлопьев или осадка (клетки, «склеенные»
антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра). РА
используют для:
1) определения антител в сыворотке крови больных, например, при
бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах
(реакция Видаля) и других инфекционных болезнях;
2) определения возбудителя, выделенного от больного;
3) определения групп крови с использованием моноклональных
антител против аллоантигенов эритроцитов.
5
Иммунология – 5 «Реакции иммунитета» № 14
если титр брюшнотифозной видовой сыворотки равен 1:12 800, это значит,
что чистая культура бактерий от больного будет идентифицирована как
брюшнотифозная только в том случае, если реакция агглютинации будет
положительна во всех разведениях сыворотки, включая 1:12 800.
Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим
раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной (контроль сыворотки),
взвесь микробов в том же растворе – равномерно мутной, без осадка
(контроль Аг).
Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той
11
же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудняет их
идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными
агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно
реагирующие АТ путем адсорбции их родственными бактериями. В таких
сыворотках сохраняются АТ, специфичные только к определенной бактерии.
С адсорбированной или монорецепторной агглютинирующей сывороткой
ограничиваются постановкой реакции на стекле. Это обусловлено тем, что
такие сыворотки не содержат перекрестно реагирующих групповых антител.
8
Иммунология – 5 «Реакции иммунитета» № 14
24
Реакция связывания комплемента (РСК) применяется для
обнаружения антител в сыворотке крови или для выявления антигена в
материале от больного. Она основана на том, что при взаимодействии
антигена с антителом образуется комплекс, который адсорбирует (связывает)
комплемент (через Fc-фрагмент антител). Однако этот феномен протекает в
пробирке без видимых проявлений. Для выявления результатов реакции в
качестве индикаторной системы используют реакцию гемолиза.
Таким образом, в РСК используют две системы: специфическую, в
которой определяют возможность образования иммунного комплекса
антитело + антиген + комплемент, и индикаторную, гемолитическую
систему, которая состоит из эритроцитов барана и гемолитической
сыворотки, содержащей антитела к эритроцитам.
Проведение реакции включает две фазы. В первой фазе проводят
25
раздельную инкубацию специфического и индикаторного комплексов. Во
второй фазе смешивают указанные комплексы, что позволяет выявить
наличие свободного комплемента по наличию или отсутствию гемолиза
эритроцитов.
Так, если имеет место соответствие антигена и антитела, происходит
связывание этим комплексом комплемента. Реакция гемолиза при этом будет
отрицательной, так как в гемолитической системе отсутствует свободный
комплемент – реакция положительная.
Если же соответствия между антигеном и антителом нет (т.е. нет
антигена или антитела в исследуемом образце), комплемент останется
свободным и во 2 фазе свяжется гемолитической системой (эритроцит-
12
Иммунология – 5 «Реакции иммунитета» № 14
26
Реакцию радиального гемолиза (РРГ) ставят в лунках геля из агара,
содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки геля
гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них
(в результате радиальной диффузии антител) образуется зона гемолиза.
Таким образом можно определить активность комплемента и
гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных
гриппом, крас–нухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах
адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля,
содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного.
27 Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами,
адсорбированными на эритроцитах, после чего к этому комплексу
присоединяются компоненты комплемента, вызывая гемолиз.
30
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА)
основана на использовании эритроцитов животных (или латекса) с
адсорбированными на их поверхности антигенами (антигенный
диагностикум) или антителами (антительный диагностикум).
Взаимодействие диагностикума с соответствующими АТ или Аг сыворотки
крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно
пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной
реакции эритроциты оседают в виде «пуговки».
31 Обычно в РНГА выявляют антитела (неизвестные) с помощью
антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой
эритроциты с адсорбированными на них антигенами известного микроба.
Диагностикум смешивают в равных количествах с сывороткой больного в
разных разведениях. При положительной реакции происходит пассивная
агглютинация эритроцитов и наблюдается осадок красного цвета.
32 Аналогичным образом проводятся исследования на выявление и
идентификацию неизвестных антигенов бактерий с использованием
антительного эритроцитарного диагностикума, на котором адсорбированы
известные АТ. Например, можно обнаружить ботулинический токсин,
добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический
диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой
гемагглютинации – РОНГА).
РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней,
определения гонадотропного гормона в моче при установлении
беременности, для выявления повышенной чувствительности к
лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.
33
Реакция гемагглютинации (РГА). Гемагглютинины вирусов
(например, вируса гриппа) обладают способностью склеивать эритроциты.
Это свойство используют в реакции гемагглютинации для индикации
вирусов. Поскольку РГА происходит без участия иммунной сыворотки
14
Иммунология – 5 «Реакции иммунитета» № 14
36
15
Иммунология – 5 «Реакции иммунитета» № 14
17
Иммунология – 5 «Реакции иммунитета» № 14
18
Иммунология – 5 «Реакции иммунитета» № 14
Иммуноблоттинг (ИБ)
49
Иммуноблоттинг (ИБ) – высокочувствительный метод, основанный на
сочетании электрофореза и ИФА или РИА.
Антигены разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном
геле, затем переносят его (блоттинг – от англ. blot, пятно) из геля на
активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с
помощью ИФА (или РИА). Фирмы выпускают полоски с «блотами»
антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после
50 инкубации отмывают от несвязавшихся АТ больного и наносят сыворотку
против иммуноглобулинов человека, меченую ферментом. Образовавшийся
на полоске комплекс антиген + антитело больного + антитело против Ig
человека выявляют добавлением субстрата/хромогена, изменяющего окраску
под действием фермента.
ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.
19